【摘要】： 目的:近年來的研究發(fā)現(xiàn),哺乳動物細胞質(zhì)膜中存在著一些脂質(zhì)組成特異、有序的局限性結(jié)構(gòu),這些膜異質(zhì)性區(qū)域被稱為“微區(qū)”(microdomain)或“脂筏”(lipid raft)。而小窩(caveolae)因為具有燒瓶底型凹陷的形態(tài)和特殊的標(biāo)記蛋白小窩蛋白(caveolin)成為脂筏重要的一個亞類,與其它類型的脂筏相區(qū)別。研究表明,脂筏參與了許多細胞外信號跨膜傳遞的過程,為膜外分子與膜受體結(jié)合提供一個微環(huán)境。同時脂筏或小窩還介導(dǎo)了細菌、病毒甚至細菌毒素、朊病毒等感染細胞,成為近年來微生物領(lǐng)域研究的重點。要研究脂筏的作用,其前期工作就是分離提取純化脂筏并對其進行鑒定。本課題組已在實驗室成功分離脂筏,并經(jīng)鑒定證實,為今后的研究工作奠定堅實的基礎(chǔ)。此外,本課題組選用副粘病毒科成員副流感病毒-3(HPIV-3)和新城雞瘟病毒(NDV)初步探討了脂筏與病毒感染的關(guān)系,以期為今后找到不同病毒通過脂筏入胞的共性,尋找新的抗病毒藥物靶點,深入了解細胞內(nèi)吞的機制打下基礎(chǔ)。 方法: 1、脂筏的分離提純與鑒定: 所有操作步驟均在0-4℃下進行。對照組用15mM甲基-β-環(huán)糊精預(yù)處理,其它操作步驟與實驗組相同。兩組細胞數(shù)均約為2×10~8個,離心收集細胞沉淀,在細胞團中加入裂解緩沖液,混勻后用Dounce勻漿器輕打10次,再放入冰盒上裂解30min后離心,離心后的上清為去核液約1ml,向去核液中加入2ml 60%的OptiPrep,使其終濃度為40%,將以上稀釋物小心放入離心管底部,用細胞裂解緩沖液稀釋OptiPrep,使其終濃度分別為30%、25%、5%。按從高到低的順序逐層加入到離心管中,每個梯度均為2ml。4℃下超速離心,100 000g,5h。從上到下依次收集離心樣品9份,每份約1ml,行免疫印跡分析。 2、脂筏介導(dǎo)HPIV-3和NDV入胞的初步探討 (1)HPIV-3和NDV分別經(jīng)雞胚增殖后測定效價, HPIV-3為1:640,NDV為1: 1280。并測定兩種病毒的TCID_(50): HPIV-3的TCID_(50)為10~(-4.2)/0.1ml;NDV的TCID50為10~(-5.3)/0.1ml。 (2)以CPE為指標(biāo)觀察藥物干預(yù)后病毒對細胞的感染性:分別以濃度5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L的甲基-β-環(huán)糊精37℃作用于MDCK細胞單層30min,之后以100TCID_(50)/0.1ml的HPIV-3或NDV 37℃吸附1.5h,于37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)4天。每日觀察特征性細胞病變(CPE)。按統(tǒng)計學(xué)方法計算各組藥物處理后病毒感染細胞的百分比。 (3)以蝕斑法測定藥物干預(yù)后病毒對細胞的感染性:配制含0.75%瓊脂的無酚紅RPMI1640 50℃保溫備用。分別用5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理MDCK細胞單層30min,之后感染10~(-5)的HPIV-3和10~(-7)NDV, 37℃吸附1.5h,加第一層瓊脂,室溫固化后置37℃5%CO_2孵箱培養(yǎng)3天,第4天鋪第二層含中性紅的瓊脂培養(yǎng)基,避光培養(yǎng)數(shù)小時或過夜,倒置顯微鏡下計數(shù)蝕斑數(shù),并進行統(tǒng)計學(xué)分析。 (4)小窩形態(tài)和NDV吸附細胞部位的電鏡觀察。 結(jié)果: 1、經(jīng)離心和免疫印跡實驗,脂筏主要位于25-30%密度梯度離心界面中,存在于收集樣品中的第5、6、7管。小窩蛋白-1的分子量約為24KD,而對照組第5、6、7管未發(fā)現(xiàn)小窩蛋白-1。 2、以CPE為指標(biāo)觀察藥物干預(yù)后病毒對細胞的感染性:甲基-β-環(huán)糊精對兩種病毒感染細胞均有一定抑制作用,且隨著劑量的增加效果明顯提高。 3、以病毒蝕斑為指標(biāo)觀察藥物干預(yù)后病毒對細胞的感染性:經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析, 10mmol/L甲基-β-環(huán)糊精和15mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理后病毒感染細胞的抑制效果均有統(tǒng)計學(xué)意義(p㩳0.01)。盡管從數(shù)據(jù)上看NDV似乎更依賴脂筏進入細胞,但兩種病毒之間對通過脂筏感染細胞的區(qū)別沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、透射電鏡下可見形態(tài)各異的凹陷狀小窩。NDV感染30分鐘,病毒吸附于細胞膜上一個小窩狀的凹陷內(nèi),同一時間段也觀察到一個病毒被一囊泡膜包裹在細胞質(zhì)中。 結(jié)論:本課題組采用密度梯度離心方法對哺乳動物細胞的脂筏成分進行了成功的分離純化和鑒定,為今后進一步研究病毒特異性成分與脂筏的關(guān)系打下堅實的基礎(chǔ)。同時我們也初步證實了NDV的感染是小窩介導(dǎo)的,HPIV-3感染細胞與脂筏相關(guān)。
【圖文】：

圖 1. 右側(cè)為蛋白質(zhì) marker,從右側(cè)數(shù)分別為第 1-9 管樣品。由圖可見，棕色沉淀主要在 3、4、5 泳道，而以第 4、5 泳道顏色更深。小窩蛋白-1 的分子量約為 24KDa

圖 1. 右側(cè)為蛋白質(zhì) marker,從右側(cè)數(shù)分別為第 1-9 管樣品。由圖可見，棕色沉淀主要在 3、4、5 泳道，，而以第 4、5 泳道顏色更深。小窩蛋白-1 的分子量約為 24KDa圖2. 左側(cè)為蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);第一泳道為對照實驗,經(jīng)甲基-β-環(huán)糊精處理,結(jié)果為陰性;第二泳道為去垢劑不溶組分,在相對分子量24KDa處可見一棕色條帶
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R373

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5 朱勇U

本文編號：2534894