【摘要】： 星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，Ast)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和正常生理功能的維持中具有重要作用。根據(jù)Ast在CNS內(nèi)的分布，將其分為白質(zhì)Ast和灰質(zhì)Ast。灰質(zhì)Ast主要與神經(jīng)元協(xié)作形成突觸網(wǎng)絡(luò)，白質(zhì)Ast則參與維持髓鞘化和非髓鞘化軸突上長距離沖動傳導(dǎo)的安全性。Ast在CNS損傷和疾病中也發(fā)揮極其重要的作用。例如Ast參與形成膠質(zhì)瘢痕(glial scar)，修復(fù)損壞的膠質(zhì)邊界以及血腦屏障等。反應(yīng)性白質(zhì)Ast參與形成CNS微環(huán)境進(jìn)而影響神經(jīng)再生，參與損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞有效地再髓鞘化等。成年哺乳動物白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4蛋白，而灰質(zhì)Ast不表達(dá)該蛋白。機(jī)械損傷導(dǎo)致白質(zhì)退形性變時，白質(zhì)Ast S100A4表達(dá)量明顯升高。然而，目前尚不清楚S100A4蛋白在CNS內(nèi)的具體作用。 第一部分S100A4蛋白在感覺神經(jīng)元再生過程中的作用 早先的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性給予S100A4蛋白處理可明顯刺激胎鼠海馬神經(jīng)元突起生長，保護(hù)胎鼠中腦及新生鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元。然而，這些結(jié)果均來自純的神經(jīng)元培養(yǎng)條件，沒有神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的相互交流。因此，本研究采用神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系，該培養(yǎng)條件能較好地反映在體的實(shí)際情況。首先，我們研究白質(zhì)Ast對背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)細(xì)胞突起生長的影響；接著，進(jìn)一步研究白質(zhì)Ast內(nèi)、外S100A4蛋白在DRG細(xì)胞突起再生過程中的作用。結(jié)果如下： 1．DRG細(xì)胞在多聚-L-賴氨酸包被的coverslip上的生長情況 我們首先檢測成年Wistar大鼠DRG細(xì)胞在多聚-L-賴氨酸包被的coverslip(沒有星形膠質(zhì)細(xì)胞)上的生長情況。在該培養(yǎng)條件下，DRG細(xì)胞可以存活，但培養(yǎng)24h未見神經(jīng)元出芽。 2．DRG細(xì)胞與對照siRNA預(yù)處理的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，DRG細(xì)胞突起生長情況 接下來，我們研究當(dāng)DRG細(xì)胞與表達(dá)S100A4蛋白的白質(zhì)Ast共同培養(yǎng)時，DRG細(xì)胞突起生長情況。免疫印跡檢測提示：對照siRNA處理的白質(zhì)Ast表達(dá)但不向胞外分泌S100A4蛋白。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)：共培養(yǎng)6h后，DRG細(xì)胞未長出突起；共培養(yǎng)12h后，DRG細(xì)胞長出較短的突起；共培養(yǎng)18h，DRG細(xì)胞突起數(shù)量、長度增加；共培養(yǎng)24h，可以看到DRG細(xì)胞長出粗且長的樹枝狀突起。對比DRG細(xì)胞在多聚-L-賴氨酸包被的coverslip上的生長情況，提示白質(zhì)Ast能支持成年DRG細(xì)胞突起生長。 3．DRG細(xì)胞與S100A4 siRNA處理的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，DRG細(xì)胞突起生長情況 為闡明胞內(nèi)S100A4蛋白的作用，我們將DRG細(xì)胞與S100A4 siRNA處理的白質(zhì)Ast共培養(yǎng)，觀察DRG細(xì)胞突起生長情況。經(jīng)S100A4 siRNA轉(zhuǎn)染，3d后白質(zhì)Ast不再表達(dá)S100A4蛋白，這時，我們將分散的DRG細(xì)胞與其共同培養(yǎng)。共培養(yǎng)6h，未見DRG細(xì)胞長出突起；共培養(yǎng)12h，可以觀察到DRG細(xì)胞長出突起；共培養(yǎng)18h、24h，DRG細(xì)胞再生突起長度繼續(xù)增加。定量統(tǒng)計分析顯示：共培養(yǎng)12、18、24h，與S100A4 siRNA處理白質(zhì)Ast共培養(yǎng)的DRG細(xì)胞突起要明顯長于與對照siRNA處理白質(zhì)Ast共培養(yǎng)的DRG細(xì)胞突起。提示白質(zhì)Ast內(nèi)的S100A4蛋白抑制成年DRG細(xì)胞突起生長。 4．DRG細(xì)胞與S100A4蛋白處理的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，DRG細(xì)胞突起生長情況 為研究胞外S100A4蛋白是否影響與白質(zhì)Ast共培養(yǎng)的DRG細(xì)胞突起生長，首先，我們制備純的白質(zhì)Ast，加入重組的S100A4蛋白(5μg／ml)預(yù)處理2h，然后將分散的DRG細(xì)胞種于其上，共同培養(yǎng)。早先的體外研究報道5μg／ml是S100A4蛋白促進(jìn)神經(jīng)突起生長的最佳濃度。共培養(yǎng)6h，未見DRG細(xì)胞長出突起；共培養(yǎng)12h，DRG細(xì)胞長出較長的突起；共培養(yǎng)18h、24h，DRG細(xì)胞突起還在繼續(xù)向外伸展。定量統(tǒng)計分析顯示：共培養(yǎng)12、18、24h，，S100A4處理組DRG細(xì)胞突起明顯長于對照siRNA處理組。而且共培養(yǎng)18h，S100A4處理組DRG細(xì)胞突起比S100A4 siRNA處理組還要長。提示與胞內(nèi)S100A4蛋白的作用相反，胞外S100A4蛋白刺激神經(jīng)突起生長。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)：白質(zhì)Ast能幫助DRG細(xì)胞突起生長；白質(zhì)Ast胞內(nèi)的S100A4蛋白抑制DRG細(xì)胞突起生長；胞外的S100A4蛋白可有效克服白質(zhì)Ast胞內(nèi)S100A4蛋白對DRG細(xì)胞突起生長的抑制作用，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。 第二部分S100A4蛋白在損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移過程中的作用 成年哺乳動物白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4蛋白，而灰質(zhì)Ast不表達(dá)該蛋白；機(jī)械損傷導(dǎo)致白質(zhì)退形性變時，白質(zhì)Ast S100A4表達(dá)量明顯升高。最近的研究報道，離體條件下抑制白質(zhì)Ast S100A4表達(dá)能增加Ast的遷移能力，S100A4蛋白有可能影響Ast對于諸如正常組織完整性破壞之類病理事件的反應(yīng)。本研究，我們通過在離體和整體水平比較S100A4(+／+)、S100A4(-／-)白質(zhì)Ast對于機(jī)械損傷(scratch)、化學(xué)損傷(ethidium bromide)的反應(yīng)，研究S100A4蛋白對于損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)Ast遷移的影響，及其在損傷后膠質(zhì)瘢痕形成中的作用。 1．細(xì)胞培養(yǎng)條件下，胞內(nèi)S100A4蛋白對scratch損傷誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響 取自P4大鼠腦胼胝體區(qū)的Ast(白質(zhì)Ast)表達(dá)較高水平的S100A4蛋白。用S100A4 siRNA轉(zhuǎn)染3d后，白質(zhì)Ast S100A4表達(dá)水平下降90％以上。對照siRNA轉(zhuǎn)染的白質(zhì)Ast S100A4表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。Scratch 24h后，在對照siRNA轉(zhuǎn)染組損傷區(qū)附近，白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4水平上調(diào)，其突起朝損傷部位延伸；Scratch 48h后，表達(dá)S100A4的Ast再生突起已長至損傷所造成的缺損區(qū)，但沒有完全覆蓋該部位。 S100A4 siRNA處理后，Scratch 24、48h，未見白質(zhì)Ast表達(dá)S100A4。損傷24h，白質(zhì)Ast已遷移至損傷部位；Scratch 48h后，白質(zhì)Ast已完全填滿缺損區(qū)。 定量分析顯示，S100A4 siRNA處理組損傷24、48h，發(fā)生遷移的Ast數(shù)量明顯多于對照siRNA處理組(P＜0.05)。 2．動物水平，胞內(nèi)S100A4蛋白對ethidium bromide注射誘導(dǎo)的白質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響 向S100A4(+／+)和S100A4(-／-)小鼠單側(cè)脊髓背索注射溴乙啶(ethidium bromide)，注射側(cè)出現(xiàn)脫髓鞘化以及膠質(zhì)細(xì)胞壞死，對側(cè)也有一定程度的類似反應(yīng)。S100A4(+／+)和S100A4(-／-)小鼠損傷程度相似。損傷4d后，S100A4(+／+)和S100A4(-／-)小鼠Ast反應(yīng)相似，但在S100A4(+／+)小鼠可見一些Ast聚集在損傷區(qū)邊緣。EB注射7d后，S100A4(+／+)小鼠脫髓鞘區(qū)邊緣有肥大的Ast聚集，而在此階段，S100A4(-／-)小鼠Ast已遷移至脫髓鞘區(qū)域內(nèi)。 結(jié)論 本研究發(fā)現(xiàn)，S100A4(-／-)白質(zhì)Ast遷移至脫髓鞘區(qū)的能力比S100A4(+／+)白質(zhì)Ast強(qiáng)。S100A4蛋白不但抑制由損傷誘導(dǎo)的CNS反應(yīng)性白質(zhì)Ast的遷移，而且參與損傷后膠質(zhì)瘢痕的形成。
【圖文】：

圖2siRNA轉(zhuǎn)染流程光胞與白質(zhì)Ast共同培養(yǎng)6，12，18，24h后，行免疫下:養(yǎng)基，用pBS(NaZHpO;1.449，KHZpO40.249，KCI餾水定容至1000ml，pll7.4)漂洗兩次;(一邊吸鮮PBS;注意不要把PBS直接加到細(xì)胞上，也不要使甲醇一20℃預(yù)冷，一20℃固定細(xì)胞5min;ritonPBS(0.PBS(0.2mlTriton/IOOmliton5mlTriton/IO0mlPBS)漂洗PBS)破膜3火5min5一10minritonPBS漂洗3X5min，5%BSA(59BSA/10OmlP
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 李建軍,周紅俊,洪毅,季京平,劉根林,粟紹強(qiáng),趙超男,董云英,方玉美,譚鵬,周天健,張愛民,鄭櫻,北京市2002年脊髓損傷流行病學(xué)調(diào)查小組;2002年北京市脊髓損傷發(fā)病率調(diào)查[J];中國康復(fù)理論與實(shí)踐;2004年07期

本文編號：2527973