【摘要】：目的建立一種利用旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)培養(yǎng)上清液中分離外泌體(exosome)的方法。方法收集BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清,低速離心去除殘余細(xì)胞,0.22μm濾器過濾除去細(xì)胞碎片,采用旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)提取外泌體。應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察所獲外泌體的形態(tài),用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)外泌體標(biāo)記物CD63、CD9蛋白的表達(dá),用CCK-8試劑盒檢測(cè)外泌體對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖活性的影響。結(jié)果使用旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)成功分離出BMSCs分泌的外泌體,透射電鏡下外泌體為圓形或橢圓形,直徑約100nm,蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示外泌體中有其特異標(biāo)記物CD63、CD9蛋白的表達(dá)。外泌體能夠促進(jìn)HUVECs增殖,并且其促細(xì)胞增殖作用隨濃度增高而增強(qiáng)。結(jié)論旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的提取外泌體的方法。
【圖文】：

值。隨后分別使用含有濃度為０、５、１０、２０、２００μｇ／ｍＬ外泌體的含ＬＳＧＳ的Ｍ－２００培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，于培養(yǎng)后１、３ｄ以同樣的方法測(cè)定Ｄ４５０值。以Ｄ４５０值的平均值為縱坐標(biāo)，孵育時(shí)間（ｄ）為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。２結(jié)果２．１外泌體的形態(tài)透射電鏡下可見，ＢＭＳＣｓ來源的外泌體為大小均勻、形態(tài)一致的圓形或橢圓形膜性小囊泡，直徑均為１００ｎｍ左右。染色后可見囊泡有完整的包膜，其內(nèi)有低電子致密物（圖１）。圖１ＢＭＳＣｓ來源外泌體的超微結(jié)構(gòu)Ｆｉｇ１ＵｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅＢＭＳＣｓ：Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇ－ｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：×４００００（Ａ）；×２０００００（Ｂ）２．２外泌體的總蛋白定量結(jié)果使用ＢＣＡ法定量外泌體總蛋白，測(cè)得樣品蛋白濃度約為（３７０．０±１２．５）μｇ／ｍＬ。每１０６個(gè)ＢＭＳＣｓ的細(xì)胞上清液中平均能提取約７．２μｇ外泌體。２．３ＣＤ９、ＣＤ６３蛋白在外泌體中的表達(dá)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，ＢＭＳＣｓ來源的外泌體表達(dá)ＣＤ９、ＣＤ６３蛋白（圖２）。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ＢＭＳＣｓ外泌體的存在。圖２ＣＤ９、ＣＤ６３蛋白在ＢＭＳＣｓ來源外泌體中的表達(dá)Ｆｉｇ２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＤ９ａｎｄＣＤ６３ｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓＢ

ｆＣＤ９ａｎｄＣＤ６３ｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓＢＭＳＣｓ：Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ２．４外泌體對(duì)ＨＵＶＥＣｓ增殖作用的影響ＣＣＫ－８法檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)１、３ｄ時(shí)，通過旋轉(zhuǎn)超濾方法提取的外泌體能提高ＨＵＶＥＣｓ的體外增殖能力，在０～２００μｇ／ｍＬ外泌體濃度范圍內(nèi)，外泌體濃度越高，ＨＵＶＥＣｓ的增殖能力越強(qiáng)（圖３）。說明旋轉(zhuǎn)超濾法能提取到有生物學(xué)功能的外泌體，外泌體中含有的某些物質(zhì)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。圖３不同濃度ＢＭＳＣｓ來源外泌體對(duì)ＨＵＶＥＣｓ增殖作用的影響Ｆｉｇ３ＥｆｆｅｃｔｏｆＢＭＳＣｓ－ｄｅｒｉｖｅｄｅｘｏｓｏｍｅ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＨＵＶＥＣｓＢＭＳＣｓ：Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣｓ：Ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ３討論旋轉(zhuǎn)超濾技術(shù)分離外泌體是利用超濾膜孔徑的大小對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)進(jìn)行允許及攔截的原理，將溶劑及部分小分子物質(zhì)過濾到膜的另一側(cè)，而將大于膜孔徑的高相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)截留在超濾膜上，從而達(dá)到分離的目的，與離心超濾分離外泌體的原理相似。不同的是，離心超濾是利用離心力將溶劑及小分子溶質(zhì)分離出去，仍然需要在１０００００×ｇ條件下離心１～２ｈ來獲得外泌體［８］。而本研究所介紹的方法是通過氮?dú)猱a(chǎn)生的壓力將細(xì)胞上清液經(jīng)１０００
【作者單位】： 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院四肢顯微外科研究所;上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院神經(jīng)外科;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81272170) 江西省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(20113BCB24018)~~
【分類號(hào)】：R329.28

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2526571