發(fā)布時(shí)間：2019-07-29 19:34

【摘要】： 前言 精液冷凍是輔助生育技術(shù)(ART)領(lǐng)域中的重要技術(shù)之一，發(fā)展至今已有200多年歷史。然而，凍融后的精液質(zhì)量仍不甚令人滿意。目前，凍融后精液質(zhì)量下降最直觀的表現(xiàn)是活力、活率的下降。此外，冷凍還可以造成精子頂體反應(yīng)，精卵融合能力的下降。冷凍對精子遺傳物質(zhì)即核DNA損傷的研究目前尚無定論。而精子核DNA完整與否關(guān)系到父方遺傳物質(zhì)能否被準(zhǔn)確無誤地傳遞給子代。因此，本研究采用彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分析冷凍復(fù)蘇過程對精子核DNA完整性的影響。 冷凍復(fù)蘇過程可導(dǎo)致精液活性氧(reactive oxidative species，ROS)產(chǎn)生增加，使精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)(oxidative stress)從而損傷精子。本研究擬在冷凍精液中分別添加精漿中主要抗氧化物質(zhì)成分：抗壞血酸鹽(ascorbate)、過氧化氫酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，探討添加這些抗氧化物質(zhì)對凍融精子可能的保護(hù)作用。用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀、流式細(xì)胞儀、彗星實(shí)驗(yàn)分析各實(shí)驗(yàn)組凍融后的精子活力(a+b％)，ROS水平，線粒體膜電位(△Ψm)，早期凋亡，核DNA完整性。 目的 1．分析冷凍復(fù)蘇過程對健康男性精子核DNA完整性的影響。 2．探討精液冷凍中添加上述幾種抗氧化物質(zhì)：抗壞血酸鹽、catalase、SOD對凍融精子可能的保護(hù)作用。 方法 1．采用彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分析冷凍復(fù)蘇過程對健康男性精子核DNA完整性的影響。 2．采用流式細(xì)胞儀檢測各組精液冷凍復(fù)蘇后的活性氧水平，線粒體膜電位水平，早期凋亡，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助精液常規(guī)參數(shù)分析以及彗星實(shí)驗(yàn)評價(jià)添加這幾種抗氧化物質(zhì)成分對凍融精子可能的保護(hù)作用。 結(jié)果 1．冷凍前原始精液彗星細(xì)胞率32.3±5.0％，冷凍復(fù)蘇后精液彗星細(xì)胞率32.5±5.0％，與冷凍前相比，差異無顯著性意義(t=1.975，P＞0.05)。核DNA損傷指標(biāo)：精子尾部DNA％(TD％)及Olive尾矩(Olive tail moment，OTM值)冷凍后與冷凍前相比明顯升高(48.2±6.3％vs 39.1±7.1％，t=2.956，P＜0.01；10.4±2.8 vs 7.4±2.3，t=2.824，P＜0.01)。 2．冷凍前原始精液a+b級精子為：64.7±4.7％，凍融后各組a+b級精子均比冷凍前下降(P＜0.01)，但抗壞血酸鹽30μM組與兩種濃度的CAT組a+b級精子下降少于陰性對照組(分別為43.5±10.0％、43.9±8.2％、44.3±9.4％vs38.1±7.9％，P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)；相對應(yīng)組的精子復(fù)蘇率也明顯高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為67.2±14.1％、68.4±13.8％、68.8±14.8％vs 58.8±10.1％，P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。而這三組ROS水平則分別低于陰性對照組(分別為29.6±12.8％、30.0±11.2％、30.1±11.0％vs36.7±17.0％，P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05)；兩種濃度CAT組的△Ψm均高于對照組(分別為34.6±12.9％、32.9±11.2％vs 27.5±10.8％，P＜0.01、P＜0.05)；活的未出現(xiàn)凋亡(PI~-Ann~-％)的精子則抗壞血酸鹽30μM組、CAT 200U組高于對照組(分別為14.0±3.8％、13.2±2.6％vs 10.1±4.0％，P＜0.01、P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余實(shí)驗(yàn)組的檢測指標(biāo)與陰性對照組相比差異無顯著性意義，P＞0.05。 3．冷凍復(fù)蘇后各實(shí)驗(yàn)組彗星細(xì)胞率與對照組相比差異無顯著性意義(P＞0.05)。添加抗壞血酸鹽300μM組，CAT200U組、400U組的核DNA損傷指標(biāo)：TD％及OTM值分別低于對照組(分別為41.0±4.2％、39.6±6.6％、40.1±6.2％vs46.1±5.6％，P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01；7.7±1.2、7.5±1.6、7.8±1.9 vs 10.1±3.1，P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01)。其余實(shí)驗(yàn)組上述指標(biāo)則與對照組之間差異無顯著性意義(P＞0.05)。 4．冷凍復(fù)蘇后各實(shí)驗(yàn)組a+b級精子，對照組和抗壞血酸鹽600μM組、兩種濃度CAT組、SOD400U組的△Ψm，以及對照組和兩種濃度抗壞血酸鹽組、CAT200U組、SOD200U組的PI~-Ann~-％均分別與本組的ROS水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05、P＜0.01)。除抗壞血酸鹽600μM組外，，其余添加抗氧化劑組TD％、OTM值則分別與其對應(yīng)組ROS有正相關(guān)性(P＜0.05、P＜0.01)。 結(jié)論 1．在慧星實(shí)驗(yàn)中，采用彗星細(xì)胞率來分析冷凍前后精液DNA損傷情況，發(fā)現(xiàn)冷凍不會(huì)造成健康男性核DNA損傷精子比例的增多；而采用TD％、OTM指標(biāo)分析，則冷凍前已損傷的精子核DNA鏈冷凍后損傷程度增加。由此可見，聯(lián)合采用彗星細(xì)胞率、TD％、OTM指標(biāo)能更全面地反映冷凍對人精子核DNA完整性的影響。 2．合適濃度抗壞血酸鹽、CAT作為抗氧化劑應(yīng)用到人精液冷凍中，可以減少冷凍技術(shù)對精液刺激產(chǎn)生的過量ROS，提高凍融精子活力，保護(hù)精子線粒體功能，和／或減輕凍融精子凋亡的發(fā)生，同時(shí)減少ROS對精子核DNA的進(jìn)一步損傷，從而改善冷凍復(fù)蘇后精子質(zhì)量。
【圖文】：

乳!J頭人學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究z}學(xué)位論文圖1一1冷凍前DNA鏈完整的精子(40x)Fig.l一IThespermwithundamagedDNA悅腸代eryoPreservation圖1一2冷凍前已有DNA鏈損傷的精子(40X)Fig.l一 2ThesPermwithdamagedDNA beforecryopreservation

Fig.l一IThespermwithundamagedDNA悅腸代eryoPreservation圖1一2冷凍前已有DNA鏈損傷的精子(40X)Fig.l一 2ThesPermwithdamagedDNA beforecryopreservation
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R321-33

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 豆偉;馬氏珠母貝精子質(zhì)量檢測方法的研究[D];廣東海洋大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2520714