【摘要】： 【研究背景及目的】 雪旺細(xì)胞(Schwann cell, SC)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的膠質(zhì)細(xì)胞。它除了在髓鞘形成、營(yíng)養(yǎng)支持及軸突再生等方面發(fā)揮重要的作用外,它還與中樞神經(jīng)系統(tǒng)非髓鞘形成的膠質(zhì)細(xì)胞一樣,發(fā)揮潛在的一些免疫功能。雪旺細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子,表達(dá)MHC-Ⅱ(Major histocompability complex)類分子及黏附分子,并發(fā)揮抗原提呈細(xì)胞的功能。 腫瘤壞死因子-alpha(Tumor necrosis factor factor-alpha, TNF-α)是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子,以可溶型和跨膜型兩種形式存在,主要介導(dǎo)免疫及炎癥反應(yīng)。在體內(nèi),坐骨神經(jīng)受損后,損傷部位的雪旺細(xì)胞被激活并產(chǎn)生TNF-α。然而,TNF-α合成的確切機(jī)制仍然不太清楚。它主要通過(guò)不同的細(xì)胞表面受體TNFR(Tumor necrosis factor factor Receptor)Ⅰ(p55)、TNFRⅡ(p75)來(lái)發(fā)揮它的生物學(xué)功能。 為證明SC作為一種重要的免疫活性細(xì)胞參與周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷或感染后的免疫炎癥反應(yīng),本課題首先從參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子——TNF-α入手,深入分析SC合成TNF-α的分子機(jī)制,然后研究以自分泌方式產(chǎn)生的TNF-α作用于雪旺細(xì)胞后所發(fā)揮的生物學(xué)功能。此研究結(jié)果為雪旺細(xì)胞作為免疫活性細(xì)胞提供了初步的理論基礎(chǔ),并且可能為臨床上雪旺細(xì)胞參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。 【方法】 (1)不同濃度,不同時(shí)間用LPS刺激雪旺細(xì)胞,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)分別檢測(cè)細(xì)胞胞液和上清中分泌的TNF-α的表達(dá)量;RT-PCR(Reverse transcript-Polymerase Chain Reaction)檢測(cè)細(xì)胞中TNF-αmRNA的表達(dá);同時(shí)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)TNF-α的細(xì)胞定位;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法( terminal deoxynucleotidyl transferase mediated deoxyuridine triphosphate nick end-labeling, TUNEL)檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞活力的影響。 (2)采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中MAPK(ERK、P38和SAPK/JNK)、NF-κB P65、IκB-α、P-IκB-α及IκB-β的活性;分別用MAPK的特異性抑制劑(PD98059、SB202190和SP600125)預(yù)處理細(xì)胞后用ELISA檢測(cè)細(xì)胞中TNF-α水平;RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中TNF-αmRNA、LITAF mRNA、CD14 mRNA、TLR4 mRNA及MyD88 mRNA的表達(dá);用間接免疫熒光單標(biāo)法檢測(cè)MAPK及NF-κB P65的表達(dá)定位。 (3)采用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNFRⅠ、TNFRⅡ在雪旺細(xì)胞上的表達(dá);為了證實(shí)TNF-α作為一個(gè)自分泌介質(zhì)激活雪旺細(xì)胞,分別采用RT-PCR或ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子在雪旺細(xì)胞上的表達(dá);采用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8)以及TUNEL反應(yīng)檢測(cè)TNF-α對(duì)細(xì)胞活力的影響. 【結(jié)果】 (1)用10μg/ml LPS刺激后2h能顯著促進(jìn)雪旺細(xì)胞漿內(nèi)TNF-α的表達(dá),同時(shí)也檢測(cè)到培養(yǎng)液上清中有TNF-α的釋放。間接免疫熒光顯示LPS刺激后TNF-α表達(dá)于雪旺細(xì)胞漿。100μg/ml LPS刺激細(xì)胞24h后可以導(dǎo)致細(xì)胞明顯的凋亡。 (2)LPS可顯著激活雪旺細(xì)胞中的ERK, P38和SAPK/JNK信號(hào)通路。ERK激活高峰在LPS刺激后30～45 min,60 min后ERK磷酸化水平開(kāi)始逐漸下降;P38和SAPK/JNK的磷酸化發(fā)生在刺激后30 min,45 min開(kāi)始逐漸下降,120 min時(shí)又達(dá)到最高水平。分別用其抑制劑PD98059、SB202190及SP600125預(yù)處理細(xì)胞后,可顯著抑制細(xì)胞TNF-α以及TNF-αmRNA的產(chǎn)生;LPS刺激細(xì)胞后引起ERK, P38和SAPK/JNK磷酸化,PD98059、SB202190及SP600125可抑制該過(guò)程。間接免疫熒光顯示:經(jīng)LPS刺激的雪旺細(xì)胞漿有磷酸化ERK、P38和SAPK/JNK的表達(dá),使用MAPK抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后,胞漿中的熒光強(qiáng)度減弱。在靜息狀態(tài)下,NFκB P65僅位于雪旺細(xì)胞漿。經(jīng)10μg/ml LPS刺激細(xì)胞20 min后,IκB-α和IκB-β通過(guò)IκB激酶(IKK)發(fā)生磷酸化后在細(xì)胞漿中降解。NFκB P65經(jīng)LPS刺激細(xì)胞10 min后移到核周區(qū),經(jīng)40 min后,P65完全轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。雪旺細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后高表達(dá)TLR4 mRNA和MyD88 mRNA,而CD14 mRNA在刺激前后都表達(dá)。 (3)RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)顯示TNFRⅠ在雪旺細(xì)胞上高表達(dá),TNFRⅡ表達(dá)較低。以自分泌介質(zhì)存在的TNF-α與雪旺細(xì)胞表面的TNFR結(jié)合可以誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生,它也可以誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)(iNOS、IL-6、IL-10)的產(chǎn)生。細(xì)胞活力檢測(cè)和TUNEL分析顯示TNF-α可以誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的凋亡。 【結(jié)論】 (1)細(xì)菌的致病因子——LPS的誘導(dǎo)確能促進(jìn)雪旺細(xì)胞高效表達(dá)和分泌炎性細(xì)胞因子TNF-α,從而為雪旺細(xì)胞作為免疫活性細(xì)胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用提供初步依據(jù)。 (2)LPS與雪旺細(xì)胞表面CD14及TLR4結(jié)合從而激活MAPK信號(hào)通路,繼而激活NFκB P65并發(fā)生核轉(zhuǎn)位,啟動(dòng)TNF-α的轉(zhuǎn)錄。MAPK信號(hào)通路的激活及NFκB P65的核轉(zhuǎn)位可能是LPS誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)的前提。通過(guò)阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)減少TNF-α及其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生,為抑制周圍神經(jīng)損傷后的炎癥以及免疫反應(yīng)發(fā)生提供了一條新的思路。 (3)在周圍神經(jīng)系統(tǒng),從激活的雪旺細(xì)胞來(lái)源的TNF-α作為一種炎癥介質(zhì)發(fā)揮著很重要的功能。一方面,它與靶細(xì)胞表面TNF-α受體結(jié)合可以誘導(dǎo)TNF-α或其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生;另一方面,它可以誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞凋亡。這種神經(jīng)保護(hù)性或神經(jīng)毒性效應(yīng)主要是通過(guò)與不同的細(xì)胞表面受體結(jié)合來(lái)介導(dǎo)的。
【圖文】：

圖 3：LPS 刺激大鼠雪旺細(xì)胞后 TNF-α mRNA 的時(shí)間依賴性表達(dá)Fig3 Time-course of TNF-α mRNA expression inLPS (10 μg/ml)-stimulatedrat Schwann cell.2.2 LPS 誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞合成 TNF-α表達(dá)的時(shí)相變化LPS 能明顯地誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞分泌 TNF-α。ELISA 結(jié)果顯示：隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)，TNF-α 水平逐漸升高，與 0 時(shí)相組比，10 μg/mlLPS 刺激后從 1 h 開(kāi)始即有 TNF-α 合成上升（P<0.05），2h 達(dá)到峰值（P<0.01），然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng) TNF-α 的合成逐漸下降。由表 1 統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，刺激組與未刺激組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而刺激 2 h與 3 h 之間 P=0.077（P>0.05），二者間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，，即刺激后 TNF-α的合成高峰在 2-3 h 之間 （圖 4）。表 1 不同時(shí)間 LPS 刺激對(duì)雪旺細(xì)胞 TNFα合成的影響Table 1. Effect of different times of LPS on TNF-α synthesistime（h） LPS （μg/ml） TNFα （pg/ml）

圖 4 TNFα 的合成量與 LPS 刺激時(shí)間之間的關(guān)系Fig 4.The relationship between the synthesis of TNFαand the stimulated times of LPSLPS 誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞合成 TNF-α?xí)r LPS 的最適濃度LISA 結(jié)果顯示：隨刺激濃度變化，TNF-α 合成水平也有明ml LPS 刺激 2 h 后 TNF-α 合成量達(dá)到最大（P<0.01）。由可以看出，刺激 1 μg/ml 與未刺激組之間 P<0.05，而刺激 1激組之間 P<0.001，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖 5）。表2 不同濃度的LPS對(duì)TNF-α合成量的影響Table 2. Effect of different concentrations of LPS on TNFα synthesisLPS （μg/ml） time（h） TNFα （pg/ml）0 2 70.79±12.56#1 2 87.72±1.03*10 2 195.08±1.77**100 2 109.56±7.96***
【學(xué)位授予單位】：南通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 李愛(ài)萍,陳光輝,李天德,王友桂,李志敏,胡大一;不同水平干預(yù)對(duì)心肌細(xì)胞ERK核轉(zhuǎn)位及c-fos表達(dá)的影響[J];中華內(nèi)科雜志;2005年02期

2 張家平,黃躍生,劉敬,周新,羅中華;燙傷大鼠心肌細(xì)胞絲裂素活化蛋白激酶的活化及胞內(nèi)分布規(guī)律的研究[J];中華燒傷雜志;2003年03期

本文編號(hào)：2519442