【摘要】： Toll樣受體(toll-like receptor，TLRs)是一類主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)、巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)上的跨膜蛋白，其識(shí)別病原體來源的產(chǎn)物，如TLR4識(shí)別革蘭陰性菌的LPS；TLR3識(shí)別病毒感染時(shí)產(chǎn)生的雙鏈RNA，而TLR9識(shí)別原核染色體和DNA病毒中的未甲基化CpG DNA基序等。TLRs在宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的抵御過程中起著關(guān)鍵性的作用，可以說TLRs控制著APC對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的APC，也是唯一能活化初始T細(xì)胞(na(?)ve T cell)的APC，在特異性激活初始T細(xì)胞、聯(lián)結(jié)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮獨(dú)一無二的作用。DC的成熟在免疫應(yīng)答中具有重要意義，是激活T細(xì)胞、啟動(dòng)免疫應(yīng)答的必要條件。表達(dá)在DC上的TLRs能識(shí)別各種不同的微生物或病毒，與相應(yīng)配體結(jié)合后能引起IL-6、IL-12等前炎癥因子的分泌、共刺激分子的上調(diào)為特征的DC活化。TLRs介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分為MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑。當(dāng)前的TLR信號(hào)模型學(xué)說認(rèn)為MyD88是TLR2、5、7、8、9轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的唯一接頭分子，而TLR3依賴TRIF-IRF3介導(dǎo)的途徑在識(shí)別病原后產(chǎn)生IFN-β。TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至少通過兩條途徑，其中，MyD88依賴途徑是TLR4介導(dǎo)細(xì)胞因子分泌所必需的，而另外一條MyD88非依賴途徑是它介導(dǎo)上調(diào)表達(dá)共刺激分子和MHC分子所必需的。近來研究發(fā)現(xiàn)不同TLRs的聯(lián)合可以產(chǎn)生更為迅速持久的DC活化，并且傾向于誘導(dǎo)Th1型反應(yīng)，而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性的Th1型免疫應(yīng)答是抗腫瘤免疫和抗感染免疫的關(guān)鍵點(diǎn)之一。此外，越來越多的研究認(rèn)為TLRs和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有密切關(guān)聯(lián)，后者能抑制DC成熟、T細(xì)胞分化和IL-2分泌，是啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的又一調(diào)控點(diǎn)，而在腫瘤部位的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫攻擊的機(jī)制之一。TLR配體介導(dǎo)的信號(hào)可以扭轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以TLR配體(LPS、Poly I：C或CpG-ODN)單獨(dú)或聯(lián)合激活DC瘤苗，觀察TLRs聯(lián)合刺激對(duì)DC表型、功能等的影響，進(jìn)而在體內(nèi)用EG7腫瘤模型研究該種經(jīng)TLR配體單獨(dú)或協(xié)同刺激的DC瘤苗對(duì)腫瘤的抑制作用及其相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制。 目的 觀察用TLRs聯(lián)合激活的DC瘤苗對(duì)C57BL/6小鼠EG7(用OVA轉(zhuǎn)染的EL4)腫瘤模型的抑制作用并探討其可能的機(jī)制，為抗腫瘤治療新方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1．在體外用TLR配體單獨(dú)或聯(lián)合刺激DC：取6-8周齡C57BL/6小鼠，無菌分離股骨、脛骨，沖洗骨髓。將收集到的骨髓細(xì)胞破去紅細(xì)胞后用DC培養(yǎng)基(mGM-CSF 10ng/ml，mIL-41ng/ml的完全培養(yǎng)基)孵箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第2天小心棄去非黏附或疏松結(jié)合細(xì)胞，在培養(yǎng)的第6天用OVA刺激后分別用LPS、PolyI：C、CpG-ODN、LPS+PolyI：C、PolyI：C+CpG-ODN刺激，24h后收集細(xì)胞，得DC_(OVA)LPS、DC_(OVA)PolyI：C、DC_(OVA)CpG-ODN、DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)、DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)，然后檢測(cè)各組DC表面CD40、CD80、CD86和MHCⅡ類分子(Ia~b)的表達(dá)，細(xì)胞上清中IL-6、IL-12p70、IL-23、INF-β的分泌水平以及各組DC刺激T細(xì)胞增殖能力的大小。 2．建立EG7腫瘤模型：C57BL/6小鼠品系，每組8只，共設(shè)7個(gè)組，分別為DC_(OVA)LPS組、DC_(OVA)PolyI：C組、DC_(OVA)CpG-ODN組、DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)組、DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)組和DC_(OVA)組，PBS為陰性對(duì)照組。各組中小鼠均右大腿外側(cè)皮下接種EG7細(xì)胞，1×10~6cells/50μl/只。 3．用OVA作為抗原，觀察各組DC瘤苗對(duì)EG7腫瘤的抑制作用：在腫瘤接種后第7天，用前面制備的DC瘤苗雙側(cè)腹股溝皮下注射(s．c．)治療各組荷瘤小鼠，1×10~6cells/100μl/只，每側(cè)注射50μl。末次治療后第7天，隨機(jī)取各組荷瘤小鼠脾細(xì)胞檢測(cè)CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率并誘導(dǎo)細(xì)胞因子和CTL。然后用LDH釋放法檢測(cè)NK、CTL殺傷活性，，用ELISA試劑盒檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子并觀察記錄腫瘤生長情況以及各組小鼠存活期。 4．?dāng)?shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理，二次方差分析，當(dāng)P＜0.01時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1．用TLR配體聯(lián)合激活的DC無論在表型還是功能上都比單一配體刺激的DC具有更高的成熟度(P＜0.01)：TLRs聯(lián)合尤其是TLR3和TLR9的聯(lián)合在活化DC時(shí)在細(xì)胞因子(如IL-12p70、IL-23、IFN-β、IL-6)的分泌、共刺激分子(如CD40、CD80、CD86分子)和MHCⅡ類分子的表達(dá)以及刺激同種異體T細(xì)胞的增殖等方面都存在顯著的協(xié)同效應(yīng)。 2．在小鼠EG7腫瘤模型中，用TLRs聯(lián)合激活的DC瘤苗進(jìn)行腹股溝皮下注射治療，顯著抑制了腫瘤的生長，且存活時(shí)間明顯延長：用TLR配體聯(lián)合激活的DC瘤苗治療后的DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)組和DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)組荷瘤小鼠的腫瘤顯著小于單獨(dú)刺激治療組或DC_(OVA)組或PBS對(duì)照組(與單獨(dú)刺激治療組或DC_(OVA)組或PBS對(duì)照組比較，P＜0.01)，而存活期顯著長于單獨(dú)刺激治療組或DC_(OVA)組或PBS對(duì)照組(與單獨(dú)刺激治療組或DC_(OVA)組或PBS對(duì)照組比較，P＜0.01)，且存活率顯著提高。 3．用TLRs聯(lián)合激活的DC瘤苗的治療增強(qiáng)了荷瘤小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性：TLR配體聯(lián)合激活的DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)組和DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)組來源的小鼠NK細(xì)胞和CTL殺傷活性與用TLR配體單獨(dú)激活的DC瘤苗治療組相比顯著增高(P＜0.01)。 4．用TLR3、4、9激活尤其是聯(lián)合激活的DC瘤苗能誘導(dǎo)荷瘤小鼠產(chǎn)生更多的Th1型細(xì)胞因子(IL-2)的分泌：DC_(OVA)LPS組、DC_(OVA)PolyI：C組、DC_(OVA)CpG-ODN組、DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)組、DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)組，DC_(OVA)組上清中Th1型細(xì)胞因子IL-2的分泌量顯著高于PBS對(duì)照組(P＜0.01)，而聯(lián)合刺激組DC_(OVA)(LPS+PolyI：C)組和DC_(OVA)(PolyI：C+CpG-ODN)組Th1型細(xì)胞因子IL-2的分泌量顯著高于DC_(OVA)LPS組或DC_(OVA)PolyI：C組或DC_(OVA)CpG-ODN組或DC_(OVA)組(與單獨(dú)刺激組或DC_(OVA)組比較，P＜0.01)。 5．用TLR3、4、9激活尤其是聯(lián)合激活的DC瘤苗能減少荷瘤小鼠脾細(xì)胞中的CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率。 結(jié)論 1．TLR配體聯(lián)合激活的DC無論在表型還是功能上都具有更高的成熟度，且能分泌更多的IL-12、IL-23等細(xì)胞因子。 2．TLR配體聯(lián)合激活的DC瘤苗能顯著抑制腫瘤生長，并延長小鼠生存期，其可能的機(jī)制與增強(qiáng)荷瘤小鼠NK和CTL殺傷活性，并加強(qiáng)Th1型細(xì)胞因子分泌以及減少荷瘤小鼠脾細(xì)胞中的CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率有關(guān)。 3．TLR配體聯(lián)合激活的DC瘤苗可望為開辟新型的基于DC的腫瘤疫苗提供了新的思路。
【圖文】：

浙江大學(xué)碩士研究生論文我們?cè)谂囵B(yǎng)第6天將非成熟DC用OVA沖擊并分別同LPS、PolyLc、CpG一ODN、(Lps+polyl:C)和(polyl:C+CPG一ODN)共培養(yǎng)，24h后將收集DC以細(xì)胞流式儀檢測(cè)DC表面分子的表達(dá)情況。如圖1所示，結(jié)果顯示用TLR配體刺激后能顯著促進(jìn)DC成熟(與DCo琳組相比，尸均<0.01)，DC表面的enso、en86、en4o和Iab分子均明顯上調(diào)。而經(jīng)LPs和Po一yl:C、Polyl:C和CpG一ODN聯(lián)合激活的DC具有更高的表型成熟度(同單獨(dú)刺激組及DCovA組相比，P<0.01)。洲區(qū)一峨氣;凡D一阮1!凡C一.小.韻，
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392;R730.5

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本文編號(hào)：2517596