【摘要】： 【目的】：1．研究豬苓多糖(polyporus polysaccharide，PPS)協(xié)同卡介苗(bacillus calmette guerin，BCG)誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4、CD14、黏附分子及共刺激分子的表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，炎癥因子的表達(dá)，探討其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答啟動機(jī)制。2．研究卡介苗在人膀胱癌細(xì)胞株T24中的直接作用部位和對T24超微結(jié)構(gòu)的影響，及豬苓多糖對其的協(xié)同作用。 【方法】：1．實驗分組，每組18只NIH小鼠(26-28g)：①對照組(皮下注射生理鹽水0.1ml／只)②BCG組(皮下注射BCG懸液1mg／只)③B+P組(BCG給藥同前，同時腹腔注射PPS 2mg／只，)④PPS組(腹腔注射PPS 2mg／只)。分別在給藥后2小時，12小時，24小時從每組各抽取6只小鼠，處死后收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。 2．應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察PPS、BCG刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR2，TLR4，CD14，CD11b，CD40的表達(dá)情況。3．用間接熒光法對PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB分子，在胞漿和胞核表達(dá)的變化以及其轉(zhuǎn)移的情況。4．運(yùn)用ELISA技術(shù)，檢測PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-12和IL-10，脾臟勻漿液中IL-2和IL-4及外周血清TNF-α的含量。5．用透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)觀察BCG在T24中的作用部位，對T24超微結(jié)構(gòu)的影響，及PPS的協(xié)同作用。6．實驗數(shù)據(jù)使用PEMS 3.0統(tǒng)計分析軟件分別進(jìn)行多個均數(shù)比較分析。 【結(jié)果】：1．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLRs表達(dá)的影響：(1)PPS組12h巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)高于對照組(P＜0.05)，24h后下降。B+P組2h后TLR2表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P＜0.05)，12h之后下降。(2)PPS組小鼠巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)在3個時點無明顯變化，在12h、24h低于對照組(P＜0.05)。B+P組2h后TLR4表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P＜0.05)。(3)PPS組小鼠巨噬細(xì)胞CD14表達(dá)在3個時點無明顯變化，在12h、24h低于對照組(P＜0.05)。B+P組2h后CD14表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P＜0.05)，之后下降。 2．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共刺激分子表達(dá)的影響：(1)PPS組12h小鼠巨噬細(xì)胞CD11b表達(dá)高于對照組(P＜0.05)，24h后下降。B+P組2h和12h CD11b表達(dá)高于PPS和BCG單用組(P＜0.05)，之后下降。 (2) PPS組小鼠巨噬細(xì)胞CD40表達(dá)在3個時點無明顯變化，在2h、12h低于對照組(P＜0.05)。B+P組2h后CD40表達(dá)高于PPS(P＜0.05)。 3．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB活化的影響：(1)PPS組NF-κB胞核熒光強(qiáng)度在3個時點內(nèi)緩慢上升，但均低于對照組(P＜0.05)；B+P組NF-κB胞核熒光強(qiáng)度高于PPS組(P＜0.05)，在12h明顯增強(qiáng)，，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(2)PPS組NF-κB胞漿熒光強(qiáng)度在3個時點呈上升趨勢，但均低于對照組(P＜0.05)；B+P組NF-κB胞漿熒光強(qiáng)度在2b和12h高于PPS組(P＜0.05)，在12h明顯增強(qiáng)。(3)PPS組NF-κB核漿熒光強(qiáng)度比在3個時點呈下降趨勢，24h低于對照(P＜0.05)；B+P組NF-κB核漿熒光強(qiáng)度比在24h明顯上升，高于PPS組和對照組(P＜0.05)。 4．PPS協(xié)同BCG體內(nèi)刺激對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響：(1)PPS組2h小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β分泌高于對照組(P＜0.05)，B+P組IL-1β分泌低于PPS組，在2h和24h有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。(2)PPS組小鼠脾勻漿上清中IL-4含量在3個時點變化不明顯，低于對照組，但無統(tǒng)計意義。B+P組IL-4含量與PPS組相近，差異無統(tǒng)計意義。(3)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清中未檢測到IL-12，IL-10和脾勻漿液中的IL-2，外周血清的TNF-α。 5．BCG對T24的直接作用及形態(tài)學(xué)觀察：BCG組2h細(xì)胞表面球狀顆粒增多，胞膜不光整，BCG與癌細(xì)胞作用24小時，細(xì)胞表面微絨毛減少，有的腫脹，長突起大部分消失，小球狀結(jié)構(gòu)增多。與PPS聯(lián)合組細(xì)胞表面出現(xiàn)較多粗的突起物。BCG被吞入胞漿或胞核，線粒體腫脹，胞漿胞核物質(zhì)丟失，細(xì)胞呈溶解趨勢。 綜上所述：1．PPS體內(nèi)單獨(dú)刺激不能促進(jìn)TLR分子的表達(dá)，聯(lián)合BCG可產(chǎn)生協(xié)同作用并促進(jìn)TLR分子和CD14的表達(dá)。2．PPS協(xié)同BCG可以促進(jìn)黏附分子CD11b分子的表達(dá)。3．PPS協(xié)同BCG作用24h促使NF-κBp65向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。4．PPS、BCG作用初期(24h)尚不能顯著誘導(dǎo)炎癥因子的釋放。5．BCG對膀胱癌細(xì)胞有直接損傷作用，PPS有協(xié)同作用。 【結(jié)論】：豬苓多糖協(xié)同卡介苗作用初期能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面CD14、TLR2和TLR4分子，及黏附分子CD11b表達(dá)增加，激活NF-κBp65，TLR分子及信號通路可能作為主要途徑之一介導(dǎo)PPS和BCG啟動機(jī)體免疫進(jìn)而引發(fā)抗腫瘤效應(yīng)。另外，BCG還可以通過直接損傷腫瘤細(xì)胞，釋放出致炎物，參與免疫啟動過程。
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圖片說明： 1.即S組N卜KB胞核熒光強(qiáng)度在3個時點內(nèi)緩慢上升，但均低于對照組(尸<0.05);B+P組N戶K日胞核熒光強(qiáng)度高于PPS組(尸<0.05)，在12h明顯增強(qiáng)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(見表2一1，圖2一1)2.即S組N卜KB胞漿熒光強(qiáng)度在3個時點呈上升趨勢，但均低于對照組(尸<0.05);B+P組NF一KB胞核熒光強(qiáng)度在Zh和12h高于PPS組(P<0.05)，在12h明顯增強(qiáng)。(見表2一2，圖2一2)3.PPS組NF一KB核漿熒光強(qiáng)度比在3個時點呈下降趨勢，24h低于對照(尸<0.05);B+P組NF一KB核漿熒光強(qiáng)度比在24h明顯上升，高于PPS組和對照組(尸<0.05)。(見表2一3，圖2一3)表2一 1NF一KB在胞核內(nèi)的表達(dá)(萬士s，n=6)grollPdose(mg/只)胞核熒光強(qiáng)度(Fn) Zh12h24heontrol 114.88士 19.43119.86士32.8 71.58士11.06*59.72士11.77*99.73士19.59今147.9士25.26*令65.42士1.87*74.77士9.17*138.73士43.55 0.1 0.1/0.2 0.210113961士 11.86*87士10.91今85.76士10.84*匕六PQ口七門DI+ BBpi*只 0.05vseontrol
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圖片說明： 1.即S組N卜KB胞核熒光強(qiáng)度在3個時點內(nèi)緩慢上升，但均低于對照組(尸<0.05);B+P組N戶K日胞核熒光強(qiáng)度高于PPS組(尸<0.05)，在12h明顯增強(qiáng)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(見表2一1，圖2一1)2.即S組N卜KB胞漿熒光強(qiáng)度在3個時點呈上升趨勢，但均低于對照組(尸<0.05);B+P組NF一KB胞核熒光強(qiáng)度在Zh和12h高于PPS組(P<0.05)，在12h明顯增強(qiáng)。(見表2一2，圖2一2)3.PPS組NF一KB核漿熒光強(qiáng)度比在3個時點呈下降趨勢，24h低于對照(尸<0.05);B+P組NF一KB核漿熒光強(qiáng)度比在24h明顯上升，高于PPS組和對照組(尸<0.05)。(見表2一3，圖2一3)表2一 1NF一KB在胞核內(nèi)的表達(dá)(萬士s，n=6)grollPdose(mg/只)胞核熒光強(qiáng)度(Fn) Zh12h24heontrol 114.88士 19.43119.86士32.8 71.58士11.06*59.72士11.77*99.73士19.59今147.9士25.26*令65.42士1.87*74.77士9.17*138.73士43.55 0.1 0.1/0.2 0.210113961士 11.86*87士10.91今85.76士10.84*匕六PQ口七門DI+ BBpi*只 0.05vseontrol
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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