【摘要】： 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)是全世界范圍內(nèi)引起感染和死亡的主要病原菌之一,是引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎和腦膜炎最常見(jiàn)的病原菌。隨著細(xì)菌耐藥株的不斷發(fā)現(xiàn),疫苗在其感染防治中的作用越來(lái)越重要。目前主要所用的是23價(jià)肺炎多糖疫苗和7價(jià)結(jié)合疫苗,但前者覆蓋的血清型有限而且不是T細(xì)胞依賴性的,對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的2歲以下小孩和老年人的保護(hù)性弱;后者存在莢膜血清型轉(zhuǎn)換和載體攜帶的莢膜多糖血清型數(shù)量有限以及生產(chǎn)成本很高,不適合在發(fā)展中國(guó)家大量使用,并且在肺炎高發(fā)人群中的保護(hù)作用小等問(wèn)題。近年來(lái),DNA疫苗由于能夠誘導(dǎo)出較好的體液免疫和細(xì)胞免疫而日益收到重視,被譽(yù)為疫苗的第三次革命。 S.pn膽堿結(jié)合蛋白A(choline binding protein A,CbpA)是S.pn主要的毒力因子之一,在肺炎鏈球菌侵襲性感染中起著重要的作用。它能與多聚免疫球蛋白受體( polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)特異性結(jié)合, S.pn通過(guò)CbpA與pIgR結(jié)合粘附到內(nèi)皮細(xì)胞后,才能侵襲粘膜屏障。CbpA既是S.pn的黏附素,又是S.pn的侵襲蛋白,CbpA分子C-末端與S.pn表面TA或LTA的膽堿結(jié)合,同時(shí)N-末端連接宿主細(xì)胞的復(fù)合糖,起到了連接細(xì)菌和宿主細(xì)胞的橋梁作用;同時(shí)CbpA是S.pn引起腦膜炎最關(guān)鍵的毒力因子。 目的:本研究擬構(gòu)建肺炎鏈球菌毒力因子CbpA DNA疫苗,將構(gòu)建好的DNA疫苗直接肌肉注射給小鼠,觀察其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答及保護(hù)效率;再將DNA疫苗與重組亞單位疫苗聯(lián)合接種給小鼠,觀察其在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答及保護(hù)效率。 方法:用PCR和基因克隆技術(shù)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/CbpA,再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,用Western blot鑒定目的基因的表達(dá),然后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn):用質(zhì)粒pcDNA3.1/CbpA、CbpA重組蛋白質(zhì),質(zhì)粒pcDNA3.1/CbpA+IL-2、質(zhì)粒pcDNA3.1/CbpA+CbpA重組蛋白質(zhì)分別免疫小鼠,免疫3次后,ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中特異性抗體水平,14天后,每只小鼠經(jīng)腹腔感染TIGR4型肺炎鏈球菌,連續(xù)監(jiān)測(cè)21天小鼠的生存時(shí)間,計(jì)算各組的生存率。 結(jié)果:①酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果顯示,S.pn CbpA基因片段被正確克隆到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中。CbpA基因片段的核苷酸序列長(zhǎng)度為1461bp,與GeneBank中序列比較,無(wú)堿基突變。②將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞,Western blot成功鑒定出目的基因CbpA的表達(dá)。③動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有的實(shí)驗(yàn)組(除對(duì)照組外)小鼠血清中都檢測(cè)到了特異性抗體,其中以50ug pcDNA3.1/CbpA+50ug CbpA重組蛋白組小鼠血清中特異性抗體水平最高。④免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): 50ug pcDNA3.1/CbpA +50ug CbpA重組蛋白聯(lián)合免疫組、50ug pcDNA3.1/CbpA +10ug CbpA重組蛋白聯(lián)合免疫組、pcDNA3.1/CbpA+IL-2組的21天存活率與對(duì)照組的差異有顯著性(P0.05)。其中50ugpcDNA3.1/CbpA+50ug CbpA重組蛋白聯(lián)合免疫組取得了100%存活率。 結(jié)論:①成功構(gòu)建和表達(dá)了pcDNA3.1/CbpA真核表達(dá)質(zhì)粒,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該DNA疫苗具有一定的免疫原性和保護(hù)性,細(xì)胞因子IL-2能增強(qiáng)CbpA DNA疫苗的免疫原性和保護(hù)效率。②CbpA DNA疫苗和CbpA蛋白質(zhì)疫苗聯(lián)合免疫可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生比單獨(dú)應(yīng)用DNA疫苗或蛋白質(zhì)疫苗較高的特異性抗體水平,CbpA蛋白質(zhì)疫苗聯(lián)合免疫可提高DNA疫苗的保護(hù)效率。DNA疫苗和蛋白質(zhì)疫苗聯(lián)合免疫是一種有價(jià)值的免疫方法。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： 30圖 1 PCR 擴(kuò)增 cbpA 基因片斷Fig.1 PCR products for CbpALane M: DNA markerLane 1: Target gene of CbpALane 2: ORF of CbpA及 PCR 鑒定A3.1(+)連接后組成了重組質(zhì)粒 pc片段（1461bp）（圖表 3）。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： 圖 2 重組 pcDNA3.1/cbpA 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant pcDNM: DNA marker;Lane 1: pcDNA3.1/cbpA digested by EcoRI anLane 2: pcDNA3.1/cbpA digested by EcoRI anDNA-cbpA 雙向測(cè)序結(jié)果A-cbpA 測(cè)序結(jié)果與 GenBank 報(bào)道序列完全TGGTACCGAGCTCGGATCCATTATGGACATGCGACAGAGAACGAGGGAGCTACCCAAATGAAAGTCAGGCAGAACAAGGAAACGAGATAAGGCAAGGAAAGAGGTC
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2515347