【摘要】： 目的：在本室構(gòu)建的bFGF抗體庫的基礎(chǔ)上，采用定點(diǎn)突變和CDR移步的方法構(gòu)建突變的bFGF噬菌體抗體庫，進(jìn)多輪篩選獲得親和力提高的Fab抗體。 方法：通過重疊PCR法對重鏈的CDR3區(qū)的八個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行NNS(N=A，T，C，GS=GC)突變，回收突變片斷，進(jìn)行SpeⅠ／XhoⅠ雙酶切后連接到連有輕鏈的Pcomb3H載體中，將構(gòu)建的重組噬菌粒載體電轉(zhuǎn)化XL1-Blue，以輔助噬菌體VCSM13超感染，構(gòu)建突變庫。用bFGF包被酶標(biāo)板，對抗體庫進(jìn)行4輪固相篩選，獲得親和力提高的bFGF Fab抗體。 結(jié)果：將突變的Fd段插入到含有輕鏈的pComb3H載體中構(gòu)建人Fab抗體突變庫，庫容約為2.5×10~6輔助噬菌體超感染后建立了人Fab噬菌體抗體庫，滴度為6.5×10~(11)pfu／mL，經(jīng)過3輪“吸附—洗脫—擴(kuò)增”的淘選富集，攜帶有抗bFGF特異性抗體的噬菌體得到了有效的富集；挑選50個(gè)克隆進(jìn)行挽救，，經(jīng)phage-ELISA檢測，獲得2個(gè)具有高bFGF特異性和高親和力的Fab噬菌體抗體克隆，可溶性表達(dá)，測定親和力常數(shù)，有1株親和力提高了2.5倍。 結(jié)論：利用定點(diǎn)隨機(jī)突變和熱點(diǎn)突變相結(jié)合的方法構(gòu)建突變庫，從中篩選到親和力提高的Fab抗體，F(xiàn)ab抗體親和力成熟改造提供有效的途徑。
文內(nèi)圖片：
圖片說明：pComb3H一Fd一K的酶切鑒定Fig3.2ldentifieationofPComb3H一Fd一K
[Abstract]:Aim: on the basis of the bFGF antibody library constructed in our laboratory, the mutant bFGF bacteriophage antibody library was constructed by site-directed mutation and CDR shift, and the Fab antibody with improved affinity was obtained by multiple rounds of screening. Methods: eight sites in the heavy chain CDR3 region were mutated with NNS (N 鈮

本文編號：2511993