【摘要】：目的構(gòu)建并鑒定小鼠SMAC特異干擾載體,并進(jìn)行慢病毒包裝。方法針對(duì)小鼠SMAC基因設(shè)計(jì)并合成3對(duì)干擾序列siRNA1、siRNA2、siRNA3及一對(duì)陰性對(duì)照序列siRNAn,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞,Real time PCR法篩選出最佳干擾序列。依據(jù)該最佳干擾序列合成DNA oligo,連接GV115載體,獲得重組干擾質(zhì)粒,PCR鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定構(gòu)建的正確性。將該重組干擾質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pHelper1.0和pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行慢病毒包裝,收集細(xì)胞上清并濃縮,梯度稀釋法測(cè)定病毒滴度。多組間比較采用方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。結(jié)果 3條siRNA對(duì)肝細(xì)胞SMAC mRNA均有不同程度的抑制作用,其中siRNA1的抑制效應(yīng)最強(qiáng),抑制效率達(dá)到70.3%。依siRNA1片段合成DNA oligo,并與慢病毒載體連接,測(cè)序顯示其構(gòu)建正確,梯度稀釋法測(cè)定慢病毒滴度為6×108TU/ml。結(jié)論成功構(gòu)建了小鼠SMAC基因特異干擾性的慢病毒,為研究SMAC基因在肝衰竭中的作用奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct and identify mouse SMAC specific interference vector and package lentivirus. Methods three pairs of interference sequence siRNA1,siRNA2,siRNA3 and a pair of negative control sequence siRNAn, were designed and synthesized for mouse SMAC gene and the best interference sequence was screened by, Real time PCR method. According to the optimal interference sequence, DNA oligo, ligated GV115 vector was synthesized, and the recombinant interference plasmid was obtained. The positive clone was identified by PCR and the correctness of the construction was identified by sequencing. The recombinant interfering plasmid and auxiliary plasmid pHelper1.0 and pHelper2.0 were co-transfected into 293T cells, and lentivirus packaging was carried out. The cells were collected and concentrated. The virus titer was determined by gradient dilution method. Variance analysis was used for comparison among multiple groups, and SNK-q test was used for further pairwise comparison. Results the three siRNA had different inhibitory effects on SMAC mRNA in hepatocytes, and the inhibitory effect of siRNA1 was the strongest, and the inhibitory efficiency was 70.3%. DNA oligo, was synthesized according to siRNA1 fragment and ligated with lentivirus vector. Sequencing showed that it was constructed correctly. The titer of lentivirus determined by gradient dilution method was 6 脳 108TU / ml. Conclusion the lentivirus specific interference of mouse SMAC gene was successfully constructed, which laid a foundation for the study of the role of SMAC gene in liver failure.
【作者單位】： 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科;華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科;
【分類號(hào)】：R393

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2503608