【摘要】： 目的克隆細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)熱休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)基因,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)并純化重組EgHSP70,對(duì)該重組蛋白進(jìn)行免疫學(xué)特性鑒定,為篩選有價(jià)值的包蟲(chóng)病候選疫苗分子奠定基礎(chǔ)。方法①利用生物信息學(xué)原理,在互聯(lián)網(wǎng)中檢索獲得EgHSP70核苷酸序列,以此作為侯選基因;從細(xì)粒棘球蚴原頭蚴中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增出EgHSP70基因,純化PCR產(chǎn)物,將其重組到pGEM-T載體后進(jìn)行序列測(cè)定和特性分析。②將測(cè)序結(jié)果輸入DNAStar分析軟件和互聯(lián)網(wǎng)SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)重組EgHSP70的特性、抗原表位及構(gòu)象進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。③構(gòu)建HSP70 /pGEX-6P-1/BL21工程菌株并對(duì)其進(jìn)行鑒定,誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白并通過(guò)SDS-PAGE鑒定。親和層析法純化重組融合蛋白HSP70/GST和重組HSP70,用實(shí)驗(yàn)室已有的細(xì)粒棘球蚴囊壁免疫的兔抗血清通對(duì)其進(jìn)行初步的免疫學(xué)鑒定。④用HSP70/GST和HSP70分別免疫小鼠,制備抗血清。通過(guò)Western blot和ELISA對(duì)重組EgHSP70的免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果①RT-PCR成功擴(kuò)增EgHSP70目的基因,并成功構(gòu)建HSP70/pGEM-T/JM109工程菌株,經(jīng)測(cè)序表明該片段由402bp組成,其開(kāi)放閱讀框完整無(wú)誤。同源性分析結(jié)果表明,與原檢索序列相比,有14個(gè)堿基不同,同源性達(dá)96%,推導(dǎo)編碼氨基酸序列同源性為81%。②DNAStar分析軟件推算氨基酸序列結(jié)果顯示,EgHSP70由133個(gè)理論氨基酸組成,分子量約為14.53kDa。DNAStar分析軟件確定了重組EgHSP70可能的抗原表位。與其他動(dòng)物熱休克蛋白70氨基酸的同源性分析結(jié)果顯示具有高度的保守性。③成功構(gòu)建HSP70/pGEX-6P-1/BL21重組表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)后獲得融合蛋白HSP70/GST分子量約為40kDa,重組EgHSP70分子量約為14kDa。Western blot證實(shí)重組EgHSP70能被免疫兔血清識(shí)別。④Western blot顯示免疫小鼠血清能夠有效識(shí)別重組蛋白;ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明,原頭蚴、囊液等天然抗原均可被免疫小鼠血清識(shí)別,與對(duì)照組相比有顯著的差異(P0.05)。提示,重組抗原可誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生特異性抗體。結(jié)論①成功克隆出EgHSP70重組抗原候選基因。②成功構(gòu)建高效融合表達(dá)基因工程菌株HSP70/pGEX-6P-1 /BL21。③動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,重組EgHSP70具有較好的免疫原性和抗原性,可望作為包蟲(chóng)病疫苗侯選分子,值得進(jìn)一步深入研究。④經(jīng)文獻(xiàn)檢索,國(guó)內(nèi)尚未報(bào)道有關(guān)EgHSP70基因的克隆及重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫學(xué)特性鑒定的研究。
[Abstract]:Objective to clone the heat shock protein 70 (Heat shock protein70,HSP70 gene of Echinococcus granulosus (Echinococcus granulosus,Eg), construct the recombinant prokaryotic expression plasmid, express and purify the recombinant EgHSP70, to identify the immunological characteristics of the recombinant protein, and lay a foundation for screening valuable candidate vaccine molecules for echinococcosis. Methods 1 according to the principle of bioinformatics, EgHSP70 nucleotides were obtained from the Internet as candidate genes. The total RNA, was extracted from Echinococcus granulosus. The EgHSP70 gene was amplified by RT-PCR, the PCR product was purified and recombined into pGEM-T vector for sequencing and characterization. 2 the sequencing results were input into DNAStar analysis software and Internet SWISS-MODEL database to predict and analyze the characteristics, antigenic epitopes and conformations of the recombinant EgHSP70. 3 the HSP70 / pGEX-6P-1/BL21 engineering strain was constructed and identified. The fusion protein was induced and identified by SDS-PAGE. Purification of recombinant fusion protein HSP70/GST by affinity chromatography and recombinant HSP70, were identified by rabbit antiserum Tong immunized with Echinococcus granulosus cyst wall in laboratory. 4 mice were immunized with HSP70/GST and HSP70 respectively to prepare antiserum. The immunological characteristics of recombinant EgHSP70 were identified by Western blot and ELISA. Results the EgHSP70 target gene was successfully amplified by 1RT-PCR and the HSP70/pGEM-T/JM109 engineering strain was successfully constructed. the sequencing results showed that the fragment was composed of 402bp and its open reading frame was complete and correct. The results of homology analysis showed that compared with the original retrieval sequence, there were 14 bases with 96% homology. The deduced amino acid sequence homology was calculated by 81%.2DNAStar analysis software. The results showed that EgHSP70 was composed of 133 theoretical amino acids, and the molecular weight was about the possible antigenic epitope of recombinant EgHSP70 determined by 14.53kDa.DNAStar analysis software. The homology analysis of amino acids with heat shock protein 70 in other animals showed that it was highly conserved. 3 the recombinant expression plasmid HSP70/pGEX-6P-1/BL21 was successfully constructed and the molecular weight of fusion protein HSP70/GST was about 40 KDa. the molecular weight of recombinant EgHSP70 was about 14kDa.Western blot, which confirmed that the recombinant EgHSP70 could be recognized by immunized rabbit serum. 4 Western blot showed that the recombinant protein could be effectively recognized in immunized mouse serum. The results of ELISA showed that the natural antigens such as procephalus and cysticercus could be recognized by the serum of immunized mice, which were significantly different from those of the control group (P 0.05). It is suggested that the recombinant antigen can induce the production of specific antibodies in immunized mice. Conclusion 1 the candidate gene .2 of EgHSP70 recombinant antigen was successfully cloned and the highly efficient fusion expression gene engineering strain HSP70/pGEX-6P-1 / BL21.3 was successfully constructed. The results showed that the recombinant EgHSP70 had good immunogenicity and antigenicity and was expected to be used as a candidate molecule for echinococcosis vaccine. 4 the cloning of EgHSP70 gene and the expression of recombinant protein have not been reported in China. Study on purification and immunological characterization.
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2503492