【摘要】： 背景 在過去的幾十年里，由于免疫抑制劑的發(fā)展，不僅使器官移植成為終末期腎、肝、心臟疾病可接受的治療方式，而且顯著減少了急性排斥的發(fā)生率，同時顯著提高了器官移植的短期、長期生存率。然而，免疫抑制劑的應(yīng)用帶來了許多問題。首先，要終身連續(xù)對免疫系統(tǒng)進行非特異性免疫抑制。第二，當前使用的免疫抑制劑中，沒有一種能完全預(yù)防急性排斥或者慢性排斥。第三，免疫抑制劑的應(yīng)用帶來了腫瘤和感染的風(fēng)險。第四，免疫抑制劑的應(yīng)用增加了移植病人高血壓的風(fēng)險以及由此導(dǎo)致的心血管并發(fā)癥。面對以上問題，新的免疫調(diào)節(jié)法增加了特異性，減少了這樣的毒副作用。在最近，細胞治療的研究取了顯著的進步。特別是凋亡細胞的靜脈輸注能誘導(dǎo)實質(zhì)器官的移植免疫耐受。在臨床工作中，一些病人對移植物無限期地形成耐受，只須使用少量的免疫抑制劑，這說明在臨床可以通過人工的方法誘導(dǎo)免疫耐受。 我們的研究小組應(yīng)用凋亡細胞誘導(dǎo)免疫耐受明顯延長鼠心臟移植的存活時間，這一思路已經(jīng)被國內(nèi)外很多實驗室所承認和重復(fù)�，F(xiàn)已證明，在許多嚙齒類小動物模型中，靜脈輸注凋亡細胞可以誘導(dǎo)供者特異性的移植免疫耐受，這給我們一個啟示，在臨床上是否也可以通過類似的方法誘導(dǎo)免疫耐受，從而有效延長移植物存活，減少免疫抑制劑的使用呢? 為了證明這個問題，我們首先選擇非人類靈長類動物進行供體凋亡細胞誘導(dǎo)免疫耐受的研究。但是，在成功應(yīng)用供體凋亡細胞誘導(dǎo)非人類靈長類動物移植免疫耐受之前，首先必須解決好以下幾個問題：(1)測定恒河猴的類人血型；(2)要找到誘導(dǎo)恒河猴外周血單個核細胞凋亡的有效方法；(3)建立合適的與臨床情況最相似、并且有利于免疫耐受研究的器官移植模型。許多文獻報導(dǎo)傳統(tǒng)的切除雙腎的恒河猴腎移植模型術(shù)后因排斥反應(yīng)、急性腎小管壞死等并癥很容易導(dǎo)致恒河猴術(shù)后7-10天死亡，不利于免疫耐受的研究，因此，要建立有利于免疫耐受研究的恒河猴腎移植模型。本文對以上幾個問題進行了研究，并初步研究了供者凋亡細胞對非人類靈長類動物同種異體腎移植移植物存活以及急性排斥反應(yīng)的影響。 目的 研究恒河猴類人血型的檢測方法；建立恒河猴同種異體腎移植模型；研究誘導(dǎo)恒河猴外周血單個核細胞凋亡的方法；研究供者凋亡細胞對恒河猴同種異體腎移植免疫耐受的誘導(dǎo)。 方法 1、43只恒河猴，肌注氯胺酮麻醉后，分別抽取靜脈血5ml，肝素抗凝。分別收集恒河猴唾液。應(yīng)用常規(guī)單克隆抗體法、凝集抑制實驗法(檢測唾液)、抗A抗B凝集素檢測法(反向定型法)共三種方法測定恒河猴的類人血型。 2、建立恒河猴同種異體腎移植模型：4只恒河猴隨機配成兩對，每只恒河猴均捐出左腎，保留右腎，同時接受另一只恒河猴的左腎移植。供腎切�。貉刂芯�切開腹部，顯露左腎。上血管夾前給予肝素(100u／kg，iv)。切下腎臟后用4℃HCA保存液50ml灌注。受者手術(shù)：沿中線切開腹部，游離腹主動脈和下腔靜脈遠端，上血管夾前靜脈注射肝素(100u／kg，iv)。腎動脈、靜脈分別于腹主動脈、下腔靜脈遠端行端側(cè)吻合。血管吻合過程中應(yīng)用顯微外科器械、7／0無損傷血管縫合線。輸尿管與膀胱吻合，并臨時留置雙豬尾支架管。術(shù)后給予阿司匹林100mg口服，共3天。術(shù)后采用亞臨床劑量免疫抑制方案：甲基強的松龍+環(huán)磷酰胺+雷帕霉素。術(shù)中、術(shù)后一天、二天靜脈注射甲基強的松龍均為120mg；環(huán)磷酰胺20mg，術(shù)前4天開始，每兩日一次；雷帕霉素0.4mg，手術(shù)日開始，每日一次。術(shù)后抗生素：硫酸慶大霉素(10000u／kg／d，IM)。 3、在我們的研究中有一個重要的問題值得注意，即細胞凋亡后很容易發(fā)生繼發(fā)性壞死，而壞死細胞對免疫的影響與凋亡細胞截然不同，因此在誘導(dǎo)細胞凋亡的同時應(yīng)盡量減少壞死細胞。為此我們比較了高能X線法、Co60γ射線法、紫外線(UVC)照射法三種方法，發(fā)現(xiàn)紫外線(UVC)照射法效果最佳，因此我們對紫外線照射法進行了詳細的研究，在不同的照射時間(40，50，60分鐘)、照射距離(15，20，30厘米)、不同的小牛血清濃度(10％，15％，20％)、不同的液面高度(0.106，0.142，0.177厘米)等條件下的凋亡率，確定誘導(dǎo)恒河猴外周血單個核細胞凋亡的最佳條件。 4、供者凋亡的單個核細胞預(yù)輸注誘導(dǎo)恒河猴同種異體腎移植免疫耐受：6只恒河猴隨機配對分為兩組，即凋亡組和對照組。凋亡組接受對照組配對供者的凋亡細胞。制備的凋亡細胞用20mlPBS液稀釋后輸注給凋亡組配對的受者。對照組輸注PBS液20ml作為空白對照處理。每只恒河猴均接受對方左側(cè)供腎，行腎移植術(shù)，保留右側(cè)腎臟。 (1)大量凋亡的單個核細胞制備 抽取供者恒河猴外周血50ml，應(yīng)用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，應(yīng)用UVC法照射單個核細胞，誘導(dǎo)單個核細胞凋亡條件：培養(yǎng)皿直徑為6cm，10％小牛血清培養(yǎng)基4ml，照射距離20cm，照射時間為60分鐘。制備凋亡細胞后應(yīng)用流式細胞計數(shù)儀檢測凋亡率，同時靜脈輸注給受者猴，7天后行同種異體腎移植術(shù)。 (2)術(shù)后免疫抑制劑的方案同前。 (3)術(shù)后動態(tài)監(jiān)測血常規(guī)、雷帕霉素濃度、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞；定期行移植腎B超、CT檢查和移植腎穿刺病理檢查，觀察移植腎存活時間。 結(jié)果 1、應(yīng)用常規(guī)單克隆抗體法檢測恒河猴類人血型沒有一例出現(xiàn)陽性凝集反應(yīng)，不能檢測出恒河猴類人血型。凝集抑制實驗(檢測唾液)檢測恒河猴唾液類人血型也未出現(xiàn)陽性反應(yīng)。所以，單克隆抗體法、凝集抑制實驗法均不能檢測出恒河猴類人血型。抗A抗B凝集素檢測法(反向定型法)能測出每只恒河猴的類人血型。43只恒河猴中類人A型3只(7％)，類人B型25只(58.14％)，，類人AB型15只(34.88％)。而未發(fā)現(xiàn)類人O型。 2、四只恒河猴左腎的切取和腎移植手術(shù)時間平均在兩小時內(nèi)完成，腎移植手術(shù)均成功，開放血流后移植腎即恢復(fù)功能，開始泌尿，術(shù)中尿量多，說明移植腎進入多尿期。術(shù)后二天移植腎彩超檢查示移植腎血供良好。移植腎存活的時間分別為5，5，6，7天。移植腎均出現(xiàn)強烈的急性排斥反應(yīng)。術(shù)后未出現(xiàn)血腫、感染、尿瘺、輸尿血管梗阻等并發(fā)癥。其中一只恒河猴移植腎出現(xiàn)腎動脈栓塞，移植腎存活5天；存活7天的恒河猴因腸梗阻而死亡。其余的猴切除排斥腎臟后均存活。與正常腎比較，術(shù)后移植腎明顯腫大，穿刺病理和移植腎切除病理示移植腎有許多炎性細胞浸潤，局灶性壞死。 3、由于在前期研究中發(fā)現(xiàn)紫外線(UVC)照射法明顯優(yōu)于高能X線法和Co60γ射線法，因此我們對紫外線誘導(dǎo)方法進行了深入探討。發(fā)現(xiàn)影響細胞凋亡的主要因素有：照射距離、照射時間、培養(yǎng)液的量、小牛血清濃度。對UVC照射法重復(fù)研究，發(fā)現(xiàn)照射距離20厘米的凋亡率顯著高于照射距離30厘米的凋亡率(P＜0.0001)、照射60分鐘的凋亡率顯著高于40、50分鐘的凋亡率(P＜0.01)，而其壞死率不超過10％、直徑6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液4ml時的凋亡率顯著高于培養(yǎng)液5ml時的凋亡率(P＜0.01)，而其壞死率顯著低于培養(yǎng)液3ml時的壞死率(P＜0.05)、用10％的小牛血清培養(yǎng)液時的凋亡率顯著高于用15％、20％的小牛血清培養(yǎng)液時的凋亡率(P＜0.005)。 4、供者凋亡細胞預(yù)輸注后恒河猴同種異體腎移植結(jié)果： 4(1)、恒河猴外周血50ml，可分離出單個核細胞數(shù)為8×10~7-8.5×10~7個，經(jīng)UVC照射后獲取的細胞總數(shù)(即為靜脈輸注的細胞總數(shù))為7.2×10~7-7.5×10~7個。其凋亡率為40-60％，壞死率為5-10％。 4 (2)、移植腎存活時間：凋亡組為7(手術(shù)原因死亡)，19，30天，對照組為5(移植腎動靜脈血管栓塞)，6，14天。 4 (3)、凋亡組：99523術(shù)后6天B超示移植‘腎血流不豐富，移植腎輕度腫大，大小53×25×35mm，活檢病理示急性排斥。術(shù)后7天死亡，死亡原因為腸梗阻，其誘因是手術(shù)中結(jié)扎了腸系膜下動脈。97387和00209術(shù)后7天B超示移植腎血流豐富，移植腎大小和結(jié)構(gòu)正常，大小分別為41×28×32mm、52×24×38mm，活檢病理見少量淋巴細胞浸潤。對照組：99581術(shù)后5天行移植腎B超檢查，發(fā)現(xiàn)移植腎明顯腫大，大小約55×25×40mm�；顧z病理檢查顯示移植腎大量淋巴細胞浸潤，廣泛局灶性的壞死。98447術(shù)后5天行B超檢查示移植腎大小為：43×18.3×37mm，無血供；即行移植腎CT檢查，靜注造影劑后，移植腎不顯影，說明移植腎無血供。手術(shù)探查切除移植腎，術(shù)中見移植腎呈紫黑色，腎動脈無搏動。腎動脈有血栓形成。切除移植腎送病理檢查顯示移植腎壞死。00473術(shù)后7天行B超檢查示移植腎結(jié)構(gòu)正常，大小為53×41×39mm，移植腎血流豐富，穿刺活檢病理見少量淋巴細胞浸潤。術(shù)后14天復(fù)查移植腎B超示血流豐富，阻力指數(shù)0.74。活檢病理見大量淋巴細胞浸潤。 4 (4)、CD4+CD25+淋巴細胞亞群的監(jiān)測：凋亡組受者97387、00209的CD4+CD25+的百分率在術(shù)前為3.49％和3.19％；術(shù)后一周達到高峰，分別為11.79％和13.58％，約是術(shù)前的3-4倍。對照組00473的CD4+CD25+在術(shù)前、術(shù)后相對穩(wěn)定。 結(jié)論 1、本研究對比了單克隆抗體法、凝集抑制實驗法和抗A抗B凝集素檢測法(反向定型法)檢測恒河猴類人血型的情況，實驗結(jié)果顯示反向定型法測定恒河猴類人血型敏感，有效；恒河猴類人血型分布以B型最多(58.14％)，AB型次之(34.88％)，A型最少(7％)；而無類人O型。而單克隆抗體法和凝集抑制實驗法不能檢測恒河猴類人血型。 2、保留一側(cè)腎的恒河猴腎移植模型與以往模型相比有以下優(yōu)勢：(1)保留了受體的原腎，更見符合臨床情況，因為在臨床上對于受體原腎均不予切除，這樣不但可以減少創(chuàng)傷，而且更有利于術(shù)后恢復(fù)；(2)保留原腎更加有利于術(shù)后維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，減少圍手術(shù)期護理的難度；(3)移植物排斥時，將排斥的移植物切除后受體猴可以長期存活，這不但更好地模擬了臨床情況，而且減少了受體猴不必要的死亡，更加符合動物的倫理學(xué)；(4)由于受體猴能夠長期存活，更有利于我們長期對受體猴進行免疫學(xué)的長期隨訪觀察，是我們進行免疫耐受研究的良好模型。 3、誘導(dǎo)恒河猴外周血單個核細胞凋亡，紫外線照射法比高能X線和γ射線法敏感，效果好。紫外線照射誘導(dǎo)恒河猴外周血單個核細胞凋亡的最佳條件是用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液，直徑6cm的培養(yǎng)皿中加培養(yǎng)液4ml，照射距離20cm，照射時間為60分鐘。 4、凋亡組的移植腎存活時間比對照組長，說明可能存在部分免疫耐受，但是，凋亡組和對照組均出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，說明術(shù)前輸注供者的凋亡細胞沒有誘導(dǎo)出完全的免疫耐受。 5、凋亡細胞輸注可誘導(dǎo)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞升高。凋亡組的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞升高可能是移植腎存活時間延長的原因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R699;R392

【參考文獻】

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本文編號：2501404