【摘要】：目的以白念珠菌Csa2蛋白為靶標(biāo),建立雙抗體夾心ELISA檢測體系,評價該方法的檢測靈敏度和特異性。方法構(gòu)建pPIC9K-Csa2重組表達載體,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,甲醇誘導(dǎo)表達、純化重組蛋白rCsa2。rCsa2蛋白分別免疫新西蘭大白兔和豚鼠制備免疫血清。以純化兔多抗和豚鼠抗血清配對,利用棋盤滴定法,確定最佳實驗條件,建立雙抗體夾心ELISA檢測系統(tǒng)。檢測rCsa2和白念珠菌不同培養(yǎng)時間的上清,確定檢測方法的靈敏度;檢測其他3種念珠菌、5種曲霉、新型隱球菌和馬爾尼菲青霉的培養(yǎng)上清,評價檢測方法的特異性。結(jié)果成功構(gòu)建表達載體并獲得真核表達重組蛋白rCsa2,經(jīng)SDS-PAGE鑒定相對分子質(zhì)量(Mr)為13 300,符合預(yù)期值;Western blot法證實該蛋白可與特異性抗體結(jié)合。免疫動物獲得高效價免疫血清,并以此成功建立雙抗體夾心ELISA,可檢測rCsa2蛋白的靈敏度約為240 pg/mL,并最早可檢測到培養(yǎng)18 h的白念珠菌培養(yǎng)上清,與其他10種臨床常見真菌的培養(yǎng)上清無交叉反應(yīng)。結(jié)論建立了有較高的檢測靈敏度和特異性的Csa2的雙抗體夾心ELISA,為區(qū)別診斷白念珠菌感染提供新的方法。
[Abstract]:Objective to establish a double antibody sandwich ELISA detection system with Csa2 protein of candida albicans as target and to evaluate the sensitivity and specificity of the method. Methods the recombinant expression vector pPIC9K-Csa2 was constructed and induced by electrotransformation of Pichia pastoris GS115, methanol. The purified recombinant protein rCsa2.rCsa2 protein was immunized to New Zealand white rabbits and guinea pigs to prepare immune serum. By pairing purified rabbit polyclonal antibody and guinea pig antiserum, the optimum experimental conditions were determined by chessboard titration, and a double antibody sandwich ELISA detection system was established. RCsa2 and candida albicans were detected for different culture time to determine the sensitivity of the detection method, and the culture smears of the other three species of candida, five kinds of Aspergillus, Cryptococcus neoformans and Penicillium marneffei were detected, and the specificity of the detection method was evaluated. Results the expression vector was successfully constructed and the eukaryotic expression recombinant protein rCsa2, was identified by SDS-PAGE as the relative molecular weight (Mr) of 13.300. The predicted; Western blot method confirmed that the protein could bind to the specific antibody. The high valence immune serum was obtained from immunized animals, and the sensitivity of double antibody sandwich ELISA, for detecting rCsa2 protein was about 240 pg/mL,. The culture medium of candida albicans cultured for 18 hours could be detected at the earliest, and there was no cross reaction with the culture medium of other 10 kinds of common clinical fungi. Conclusion A double antibody sandwich ELISA, with high sensitivity and specificity for Csa2 detection is established to provide a new method for the differential diagnosis of candida albicans infection.
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部;突發(fā)傳染病病原微生物醫(yī)學(xué)重點實驗室;海南省人民醫(yī)院檢驗科;香港大學(xué)微生物系;
【基金】：廣東省高等學(xué)校珠江學(xué)者崗位計劃(2009 GDUPS) 廣東省高校感染性疾病診斷試劑工程技術(shù)研究中心建設(shè)項目(GCZX-A1106) 國家自然科學(xué)基金青年項目(81101299,81101320)
【分類號】：R392-33

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本文編號：2498849