【摘要】： 多聚免疫球蛋白受體(polymeric Ig receptor, pIgR)是免疫球蛋白超家族中的一員,作為特異性受體介導(dǎo)pIgA/pIgM的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),它主要位于幾種腺上皮細(xì)胞如肝細(xì)胞、乳腺細(xì)胞和某些物種肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上、粘膜上皮細(xì)胞如胃腸道、呼吸道上皮細(xì)胞等。研究表明,在胃癌、子宮內(nèi)膜癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌和肺腺癌等腫瘤組織中,pIgR都是呈現(xiàn)異常變化的,并且隨著癌變程度的不同在數(shù)量表達(dá)上也出現(xiàn)不同。這提示pIgR與腫瘤有著密切的聯(lián)系。 糖鏈作為生物信息分子參與了胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子識(shí)別過(guò)程,具有重要的生理功能,而且在許多重大疾病,如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,都有糖類物質(zhì)的參與。人多聚免疫球蛋白受體(human polymeric Ig receptor, hpIgR)是一種高度N糖基化的蛋白,包含高達(dá)25%的碳水化合物,含有七個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證實(shí):高表達(dá)hpIgR的MDCK細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)現(xiàn)象。而EMT在多種上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。但hpIgR上高達(dá)25%的N-糖鏈?zhǔn)欠裨谝陨险劶暗哪[瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用卻沒(méi)有報(bào)導(dǎo)�；诖�,本實(shí)驗(yàn)采用定點(diǎn)突變的技術(shù)獲得N-糖基化位點(diǎn)突變的hpIgR基因片段,真核轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞株,獲得穩(wěn)定表達(dá)各突變體的細(xì)胞株,然后觀察轉(zhuǎn)染了各突變體細(xì)胞在增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞行為學(xué)方面的變化,進(jìn)而探討了hpIgR上的糖鏈對(duì)hpIgR高表達(dá)致MDCK細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。 1 N糖鏈缺失的hpIgR高表達(dá)MDCK細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定 1)獲得人多聚免疫球蛋白受體pcDNA3.1-hpIgR質(zhì)粒后,采用定點(diǎn)突變技術(shù)首先構(gòu)建了七個(gè)單N-糖基化位點(diǎn)突變型質(zhì)粒pcDNA-cmyc-hpIgR并測(cè)序驗(yàn)證成功,用于下步構(gòu)建兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)同時(shí)突變的質(zhì)粒。以構(gòu)建成功的單點(diǎn)突變體為模板,進(jìn)一步采用定點(diǎn)突變的方法,構(gòu)建了四個(gè)雙糖基化位點(diǎn)突變型質(zhì)粒pcDNA-cmyc-hpIgR并測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功,可以用于下步MDCK轉(zhuǎn)染雙糖基化位點(diǎn)突變型質(zhì)粒pcDNA-cmyc-hpIgR的實(shí)驗(yàn)。 2 )運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將N-糖基化位點(diǎn)突變的pcDNA3.1-cmyc-hpIgR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,獲得突變型hpIgR高表達(dá)細(xì)胞株;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-cmyc空質(zhì)粒作為對(duì)照,G418篩選出穩(wěn)定克隆。采用Western blotting、免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定轉(zhuǎn)染效果及hpIgR表達(dá),結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)有大量目的蛋白表達(dá),表明轉(zhuǎn)染成功。 2 N糖鏈缺失對(duì)高表達(dá)hpIgR的MDCK細(xì)胞影響的研究 利用上述構(gòu)建成功的四種缺失不同位置N-糖鏈的hpIgR高表達(dá)MDCK細(xì)胞,應(yīng)用SRB法檢測(cè)了各突變體細(xì)胞株的增殖能力,應(yīng)用劃痕法檢測(cè)了突變體細(xì)胞株的遷移能力,應(yīng)用鋪有Matrigel的Transwell小室檢測(cè)了細(xì)胞的侵襲能力,應(yīng)用共聚焦顯微鏡檢測(cè)了細(xì)胞骨架F-Actin和E-cadherin在各細(xì)胞株的表達(dá),應(yīng)用Western blotting檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)磷酸化的Erk1/2的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:hpIgR胞外各Domain內(nèi)的N-糖鏈缺失并沒(méi)有明顯影響細(xì)胞的增殖;但Domain4和Domain5的N-糖鏈缺失卻比較明顯的影響了細(xì)胞的侵襲能力;而Domain4和Domain5的N-糖鏈缺失對(duì)遷移能力影響較大,并且還影響細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白F-actin重排和E-cadherin的含量,但磷酸化ERK1/2并沒(méi)有明顯的變化。以上結(jié)果顯示hpIgR胞外Domain4和Domain5的N-糖鏈在高表達(dá)hpIgR致MDCK細(xì)胞向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到非常重要的作用。 綜上所述,采用定點(diǎn)突變、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等不同實(shí)驗(yàn)手段獲得了N糖鏈缺失的hpIgR高表達(dá)MDCK細(xì)胞株,并且發(fā)現(xiàn)hpIgR胞外Domain4和Domain5區(qū)域內(nèi)的N-糖鏈在高表達(dá)hpIgR致MDCK細(xì)胞向惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到非常重要的作用。這為研究hpIgR糖蛋白上的糖鏈生物學(xué)功能提供了重要依據(jù),也為糖生物學(xué)的研究提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392;R730.2

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本文編號(hào)：2485831