【摘要】： [目的]糖尿病是日常生活常見(jiàn)疾病之一,糖尿病下肢潰瘍是其并發(fā)癥之一,且經(jīng)久難愈,因此糖尿病難愈創(chuàng)面成為人們研究的熱點(diǎn)。表皮干細(xì)胞作為皮膚發(fā)生修復(fù)重建的關(guān)鍵源泉,糖尿病創(chuàng)面難愈是否與此有關(guān)呢?本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討細(xì)胞基質(zhì)糖基化對(duì)表皮干細(xì)胞黏附、增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響,進(jìn)一步尋找糖尿病創(chuàng)面難愈機(jī)制。 [方法]利用Ⅳ膠原的快速黏附法分離培養(yǎng)表皮干細(xì)胞。然后利用免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光化學(xué)分別對(duì)角蛋白19和β1整合素進(jìn)行鑒別。制作并鑒定糖基化Ⅳ膠原,將制備的表皮細(xì)胞懸液分別接種在包被有正常Ⅳ膠原和糖基化Ⅳ膠原(膠原糖基化7天,14天,21天)的6孔板上。15分鐘后,每個(gè)組取3個(gè)孔,洗去未黏附細(xì)胞,分別計(jì)算其黏附率并進(jìn)行比較;取第2代表皮干細(xì)胞,以5×10~3接種于預(yù)先包被有正常Ⅳ膠原和糖基化Ⅳ膠原的96孔板內(nèi),分別取培養(yǎng)3小時(shí)、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天細(xì)胞每天取5孔用MTT比色法測(cè)OD值,取其平均值并繪制生長(zhǎng)曲線圖;取第2代成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的糖基化組和正常膠原組細(xì)胞,按200/孔接種6孔板,2周之后測(cè)定克隆生成率;表皮干細(xì)胞按1×10~6/孔接種于包被有正常膠原和糖基化膠原6孔板上,培養(yǎng)6天和10天后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V Fitc比較兩者細(xì)胞凋亡情況。 [結(jié)果]培養(yǎng)出來(lái)的表皮干細(xì)胞通過(guò)鑒定角蛋白19和β1整合素均有陽(yáng)性表達(dá);Ⅳ膠原糖基化7天,糖基化Ⅳ膠原的熒光值為1.864±0.126,而此時(shí)正常未進(jìn)行糖基化的Ⅳ膠原熒光值為0.699±0.0831,糖基化14天,糖基化Ⅳ膠原的熒光值為3.051±0.112,而正常Ⅳ膠原熒光值為0.765±0.0927;糖基化21天,糖基化Ⅳ膠原的熒光值為4.416±0.1378,而正常Ⅳ膠原熒光值為0.8254±0.058;膠原在高糖下孵育7天時(shí),糖基化組與正常膠原組黏附率沒(méi)差異,P值＞0.05;膠原在高糖下孵育14天時(shí)糖基化組比正常組黏附率低,P值＜0.05,21天時(shí)糖基化組比正常組黏附率顯著降低,P值＜0.01;可見(jiàn)隨著糖基化程度的加深,對(duì)表皮干細(xì)胞的黏附率逐漸降低;通過(guò)MTT繪制表皮干細(xì)胞在正常Ⅳ膠原和糖基化Ⅳ膠原上的生長(zhǎng)曲線,可以看出在4天前細(xì)胞增殖緩慢,兩者間沒(méi)有差異,6天后開(kāi)始出現(xiàn)差異,正常膠原組細(xì)胞增長(zhǎng)速度要快于糖基化組;表皮干細(xì)胞在正常Ⅳ膠原和糖基化Ⅳ膠原上的克隆生成率比較:糖基化組為(38.5±1.9)%,正常膠原組為(32.7±1.5)%,糖基化組克隆生成率低于正常組膠原組。P＜0.05;表皮干細(xì)胞在正常Ⅳ膠原和糖基化Ⅳ膠原上的凋亡比較:細(xì)胞孵育6天時(shí),正常膠原組Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(10.7±0.9438)%,而糖基化膠原組為(16.22±0.7912)%;細(xì)胞孵育第10天時(shí)正常膠原組Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(4.66±0.7368)%,而糖基化膠原組為(8.266±0.8177)%。糖基化膠原組較正常膠原組Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。P＜0.05 [結(jié)論]基質(zhì)糖基化抑制了表皮干細(xì)胞的黏附和增殖,促進(jìn)了表皮干細(xì)胞的凋亡,可能是糖尿病創(chuàng)面難愈機(jī)制之一。
[Abstract]:[Objective] Diabetes is one of the common diseases of daily life, and the ulceration of lower limb of diabetes is one of its complications, and it is difficult to heal for a long time. Skin stem cells are the key source of the skin repair and reconstruction. The effects of cell matrix glycosylation on adhesion, proliferation and apoptosis of epidermal stem cells were discussed in this experiment. [Methods] The culture of the skin was isolated by the rapid adhesion of the collagen 鈪，

本文編號(hào)：2481457