【摘要】：我們實驗室于1998年從藍藻中克隆獲得了別藻藍蛋白基因(apc)。將該基因 重組到大腸桿菌表達質(zhì)粒PET28a+中,實現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高效表達。 純化的產(chǎn)物(rAPC)經(jīng)小鼠試驗證實,不管是口服給藥還是腹腔注射給藥,微量的 該重組蛋白便可顯著抑制S180肉瘤細胞和肝癌細胞,抑瘤率為40%-60%。但在 大腸桿菌中表達的重組蛋白存在后期的分離純化繁瑣,需要包涵體復(fù)性以及含有 大腸桿菌毒素等不利因素。由于rAPC口服給藥有效,這提示我們可以開發(fā)一種 直接口服的治療癌癥的新藥。由于植物表達系統(tǒng)具有高效表達外源目的基因、生 物安全性好、可以直接口服等特點,已成為生物反應(yīng)器的熱點之一。別藻藍蛋白 基因來源于原核的藍藻,密碼子的偏好性等均具有原核性質(zhì),因此我們選擇了用 衣藻葉綠體表達系統(tǒng)來表達這種藥用蛋白。為進一步開發(fā)口服抗腫瘤藥用蛋白奠 定基礎(chǔ)。 本論文研究的第一部分探索了進行衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化所涉及的各種方法,如: 基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)、篩選方法及對轉(zhuǎn)化子的各種分子檢測方法等。通過對以上方法 的探索,初步建立了利用同源重組方法在衣藻葉綠體中穩(wěn)定表達外源基因的體 系。 本論文研究的第二部分構(gòu)建了外源基因apc的衣藻葉綠體表達載體:papc-S, 并用基因槍法將該載體導(dǎo)入衣藻細胞,通過抗性篩選后,在壯觀霉素抗性平板上 得到了15個墨綠色的衣藻轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過三輪抗性篩選后,利用一對分別互補于 衣藻葉綠體chlL,基因5’端和外源基因apc 3’端的引物對轉(zhuǎn)化子進行了PCR檢測, 同時以apc基因為探針對轉(zhuǎn)化子進行了酶切Southern檢測,結(jié)果證實外源基因已 經(jīng)定點整合到了衣藻葉綠體特定位點。以天然APC蛋白免疫兔獲得的抗血清為 一抗,經(jīng)Western雜交證實外源基因已在衣藻葉綠體中獲得了表達,經(jīng)定量ELISA 檢測證實外源基因在衣藻中的表達量占可溶性總蛋白的2—3%。 由于在大腸桿菌中重組的別藻藍蛋白β亞基的抗腫瘤活性大大高于完整的 重組的APC蛋白。因此論文研究的第三部分構(gòu)建了別藻藍蛋白β亞基的衣藻葉 綠體表達載體papc-B。用基因槍法將之導(dǎo)入衣藻細胞后,經(jīng)各種分子水平的檢
[Abstract]:The allophycocyanin gene (apc). Was cloned from blue algae in our laboratory in 1998. The gene was recombined into E. coli expression plasmid PET28a to realize the high expression of the gene in E. coli. The purified product (rAPC) was confirmed by mouse test that the recombinant protein could significantly inhibit S180 sarcomas and liver cancer cells by oral administration or intraabdominal injection, and the tumor inhibition rate was 40% 鈮，

本文編號：2477273