【摘要】：目的探討吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)基因轉(zhuǎn)染修飾大鼠BMSCs對同種異體復(fù)合組織移植免疫排斥反應(yīng)的影響及其機制。方法以IDO過表達慢病毒IDO[綠色熒光蛋白(green fl uorescent protein,GFP)]-Lenti轉(zhuǎn)染供體4~6周齡BN大鼠來源的第3代BMSCs,篩選目的基因高表達、具有生物活性的細(xì)胞株IDO-BMSCs。行RT-PCR、Western blot檢測基因修飾前后BMSCs中IDO mRNA及蛋白表達,通過測量培養(yǎng)上清犬尿氨酸生成量檢測IDO生物學(xué)活性。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中以IDO-BMSCs、反應(yīng)細(xì)胞(受體4~6周齡LEWIS大鼠來源外周血單個核細(xì)胞)和刺激細(xì)胞(供體BN大鼠來源外周血單個核細(xì)胞)混合培養(yǎng),細(xì)胞比例分別為1∶5∶5、1∶10∶10、1∶50∶50及1∶100∶100(實驗組1、2、3、4);每個反應(yīng)體系另設(shè)IDO阻斷孔,加入1 mmol/L IDO特異性抑制劑1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan,1-MT);以IDO-BMSCs與反應(yīng)細(xì)胞(1∶5)培養(yǎng)為陰性對照組,刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞(1∶1)培養(yǎng)為陽性對照組,IDO-BMSCs在RPMI1640培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)作為空白對照組。于培養(yǎng)5 d,采用MTT法檢測T淋巴細(xì)胞增殖情況。進一步制備大鼠同種異體肢體移植模型,將GFP-BMSCs(A組)、IDO-BMSCs(B組)及生理鹽水(C組)分別經(jīng)尾靜脈輸入移植模型,觀察移植物存活時間及免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果基因修飾后,BMSCs中IDO mRNA及蛋白表達顯著提高。IDO-BMSCs較GFP-BMSCs可明顯提高培養(yǎng)上清中犬尿氨酸含量(P0.05)。加入1-MT前,實驗組1、2、3的T淋巴細(xì)胞增殖率隨IDO-BMSCs與反應(yīng)細(xì)胞比例逐漸減少而不斷增加,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);實驗組4的T淋巴細(xì)胞增殖率與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。加入1-MT后,除實驗組4的T淋巴細(xì)胞增殖率與加入前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)外,其余各實驗組均高于加入前(P0.05)。體內(nèi)輸入后,IDO-BMSCs可在移植物內(nèi)定植,抑制免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生;A、B、C組移植物存活時間分別為(11.5±0.6)、(14.5±0.8)、(9.0±0.3)d,B組存活時間明顯長于A、C組,A組長于C組(P0.05)。結(jié)論 IDOBMSCs可促進大鼠同種異體復(fù)合組織移植物的成活,其機制與抑制T淋巴細(xì)胞增殖、促進BMSCs向移植物內(nèi)定植有關(guān)。
[Abstract]:Aim to investigate the effect of indoleamine 2, 3-dioxygenase (indoleamine-2) gene transfection on the immune rejection of allogeneic composite tissue transplantation in rats and its mechanism. Methods BMSCs-modified rats were transfected with indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO) gene. Methods IDO overexpressed lentivirus IDO [green fluorescent protein (green fl uorescent protein,GFP]-Lenti was transfected into the third generation BMSCs, derived from 4-6-week-old BN rats to screen the target gene of IDO-BMSCs. cell line with high expression and biological activity. RT-PCR,Western blot was used to detect the expression of IDO mRNA and protein in BMSCs before and after gene modification, and the biological activity of IDO was detected by measuring the production of urine in cultured canine supernatant. In the mixed lymphocyte reaction system, IDO-BMSCs, reactive cells (peripheral blood mononuclear cells from 4-week-old LEWIS rats) and stimulating cells (peripheral blood mononuclear cells from donor BN rats) were co-cultured. The proportion of cells was 1-5-5, 1-10-10, 1-50-50 and 1-100-100, respectively (experimental group 1, 2, 3, 4). IDO blocking pore was set up in each reaction system, and 1-mmol/L IDO specific inhibitor 1-methyl-tryptophan (1-MMT) was added to each reaction system in the presence of 1-methyltryptophan (1-methyltryptophan). IDO-BMSCs and reactive cells (1:5) were used as negative control group, stimulating cells and reactive cells (1:1) were cultured as positive control group, and IDO-BMSCs was cultured in RPMI1640 medium as blank control group. After 5 days of culture, the proliferation of T lymphocytes was detected by MTT method. GFP-BMSCs (group A), IDO-BMSCs (group B) and saline (group C) were injected into the model by tail vein to observe the survival time and immune rejection. Results the expression of IDO mRNA and protein in BMSCs was significantly increased after gene modification, and the content of urine in cultured supernatant was significantly increased by IDO-BMSCs than that of GFP-BMSCs (P0.05). Before adding 1-MT, the proliferation rate of T lymphocytes in experiment group 1, 2 and 3 increased with the decrease of the ratio of IDO-BMSCs and reactive cells, and the difference between groups was statistically significant (P0.05). There was no significant difference in T lymphocyte proliferation rate between experimental group 4 and positive control group (P0.05). After the addition of 1-MT, there was no significant difference in T lymphocyte proliferation rate between experimental group 4 and pre-addition group (P0.05), and all the other experimental groups were higher than those before addition (P0.05). After administration in vivo, IDO-BMSCs could be implanted in the graft to inhibit the occurrence of immune rejection. The graft survival time in group A, B and C was (11.5 鹵0.6), () 14.5 鹵0.8), (9.0 鹵0.3 days, respectively. The survival time in group B was significantly longer than that in group A, and in group C, the survival time of group A was significantly longer than that in group C (P0.05). Conclusion IDOBMSCs can promote the survival of allogeneic composite tissue graft in rats, and its mechanism is related to the inhibition of T lymphocyte proliferation and the promotion of BMSCs implantation into the graft.
【作者單位】： 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍燒傷中心;
【基金】：國家自然科學(xué)基金青年項目(81301632)~~
【分類號】：R392

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本文編號：2470820