【摘要】： 單克隆抗體具有高度的特異性及均一性，應(yīng)用廣泛，目前制備單克隆抗體的方法成本高，產(chǎn)量低，程序繁雜，周期長(zhǎng)。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的迅速發(fā)展對(duì)高親和力的單克隆抗體的需求迅速增加，對(duì)傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)芯片是將大量蛋白質(zhì)分子按預(yù)先設(shè)置的排列固定于一種載體表面行成微陣列，根據(jù)蛋白質(zhì)分子間特異性結(jié)合的原理以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的準(zhǔn)卻、快速、大信息量的檢測(cè)。將單克隆抗體的特異性同蛋白質(zhì)芯片的高通量相結(jié)合是未來(lái)高通量制備單克隆抗體的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)的目的在于尋找高通量制備單克隆抗體的方法。 首先，用基因工程的方法分別在兩個(gè)表達(dá)載體構(gòu)建了4個(gè)蛋白的融合載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，不同的載體蛋白帶有不同的標(biāo)簽，分別用來(lái)免疫及篩選，解決了單抗篩選中抗標(biāo)簽抗體的干擾；傳統(tǒng)方法在抗原免疫時(shí)采用一只小鼠一次免疫一種抗原，本實(shí)驗(yàn)將4個(gè)純化后的蛋白同時(shí)免疫一只小鼠后用傳統(tǒng)方法制備單克隆抗體；對(duì)單抗進(jìn)行Western blot及間接免疫熒光的驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)行了蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)，比較常規(guī)的ELISA方法與蛋白質(zhì)芯片的吻合性。 結(jié)果顯示，8個(gè)融合蛋白在宿主菌中以包涵體的形式得到高表達(dá)；混合免疫小鼠后，通過(guò)一次細(xì)胞融合，用雜交瘤技術(shù)篩選得到了針對(duì)4個(gè)蛋白的24株單克隆抗體；并對(duì)24株抗體進(jìn)行了Western blot及間接免疫熒光驗(yàn)證，其中的7株能用于Western blot實(shí)驗(yàn)，且具有良好的特異性，5株能用于間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，識(shí)別胞漿內(nèi)蛋白；同時(shí)對(duì)24株單克隆抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)，共檢測(cè)了88個(gè)樣品，傳統(tǒng)的ELISA方法和蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)結(jié)果的復(fù)合率為76％，，顯示兩者具有良好的一致性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)混合免疫和以抗原包板的芯片進(jìn)行篩選的方法，嘗試建立通量制備鼠單克隆抗體的新方法。
[Abstract]:Monoclonal antibodies are highly specific and homogeneous, and are widely used. At present, the preparation of monoclonal antibodies has the advantages of high cost, low yield, complicated program and long period. With the rapid development of proteomics in recent years, the demand for monoclonal antibodies with high affinity has increased rapidly, which challenges the traditional hybridoma technique. Protein chip is a kind of microarray formed by fixing a large number of protein molecules on the surface of a carrier in a predetermined arrangement. According to the principle of specific binding between protein molecules, the detection of biomolecules can be realized quickly and with a large amount of information. Binding the specificity of monoclonal antibody to high throughput of protein chip is the trend of producing monoclonal antibody in the future. The aim of this experiment is to find a high-throughput method for the preparation of monoclonal antibodies. Firstly, the fusion vectors of four proteins were constructed in two expression vectors by genetic engineering, and expressed in E. coli. Different vector proteins were labeled with different tags, and were used for immunization and screening, respectively. The interference of anti-label antibody in the screening of monoclonal antibody was solved. In the traditional method, one mouse was used to immunize one antigen at a time. In this experiment, four purified proteins were simultaneously immunized into one mouse and then monoclonal antibodies were prepared by traditional methods. The monoclonal antibody was tested by Western blot and indirect immunofluorescence, and the protein chip was detected. The coincidence of the conventional ELISA method with the protein chip was compared. The results showed that eight fusion proteins were highly expressed in the form of inclusion bodies in host bacteria, and 24 monoclonal antibodies against four proteins were obtained by hybridoma technique after the mice were immunized by mixed immunization with one cell fusion, and 24 strains of monoclonal antibodies against 4 proteins were obtained by hybridoma technique, and 24 monoclonal antibodies against 4 proteins were obtained by hybridoma technique. The results of Western blot and indirect immunofluorescence showed that 7 of the 24 antibodies could be used for Western blot test and had good specificity. 5 strains could be used for indirect immunofluorescence assay to recognize cytoplasmic proteins. At the same time, 24 monoclonal antibodies were detected by protein chip, and 88 samples were detected. The combination rate of traditional ELISA method and protein chip detection was 76%, which showed good consistency between the two methods. In this experiment, we tried to establish a new method of producing mouse monoclonal antibody by mixed immunization and screening with antigen-coated chip.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2469236