【摘要】：早期造血生長(zhǎng)因子FL是酪氨酸激酶Ⅲ受體(Flt3)的配體,與受體結(jié)合后能夠調(diào)節(jié)最原始的造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化,動(dòng)員和刺激髓系及淋巴祖細(xì)胞、DCs和NK細(xì)胞增殖和分化,是樹突狀細(xì)胞(DC)最為重要的生長(zhǎng)因子;可與多種細(xì)胞因子協(xié)同,提高造血功能,與IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ等抗腫瘤因子有協(xié)同效應(yīng),從而在機(jī)體抵抗腫瘤的免疫過程中起重要作用。 本文從K562細(xì)胞中分離出人FL的胞外段基因(hsFL),與pcDNA3表達(dá)載體相連,構(gòu)建了pcDNA3/hsFL真核表達(dá)質(zhì)粒,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后進(jìn)行RT-PCR、Western blot、ELISA及一系列生物學(xué)活性鑒定的檢測(cè);同時(shí)還將hsFL與原核表達(dá)載體pQE30相連構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒,并進(jìn)行了表達(dá)和純化。 結(jié)果表明:本實(shí)驗(yàn)獲得的hsFL cDNA序列與Genbank的登錄結(jié)果一致,有兩處點(diǎn)突變,但所表達(dá)的氨基酸未變;發(fā)現(xiàn)了兩種hsFL的剪變體,對(duì)這兩種剪變體的研究目前正在進(jìn)行中。pcDNA3/hsFL真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)有目的基因的mRNA存在,說明能夠有效地轉(zhuǎn)錄hsFL基因;Western blot有特異條帶出現(xiàn),與預(yù)期位置一致;ELISA法測(cè)得72h后培養(yǎng)上清中的hsFL含量為56.8ng/ml/1×106cells,并且分泌的hFL能促HL-60細(xì)胞增殖,在無血清培養(yǎng)的條件下還能促進(jìn)Raji細(xì)胞的生存和抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。說明通過該真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的蛋白質(zhì)具有良好的生物學(xué)活性。構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30/hsFL,表達(dá)出可溶型FL蛋白,并進(jìn)行了純化。原核表達(dá)蛋白Western blot在預(yù)期位置出現(xiàn)條帶,造血集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)原核系統(tǒng)表達(dá)的hsFL蛋白與SCF、GM-CSF、IL-3有協(xié)同作用,表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性。
[Abstract]:Early hematopoietic growth factor FL is the ligand of tyrosine kinase 鈪，

本文編號(hào)：2467488