【摘要】：自從發(fā)現(xiàn)雙鏈21堿基小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)可以引發(fā)特異性的基因沉寂,雙鏈RNA(double—strand RNA,dsRNA)介導(dǎo)的RNA干涉(RNA interference,RNAi)已經(jīng)逐漸在抑制基因表達(dá)方面得到了廣泛的應(yīng)用。目前廣泛應(yīng)用的體外合成RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法有合成成本高、轉(zhuǎn)染效率低、不能持續(xù)發(fā)揮作用等缺點。構(gòu)建siRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后可形成大量的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的小RNA(short hairpin RNA,shRNA),而這些shRNA可特異地抑制基因的表達(dá)。 猿猴病毒SV40可引起生物形成多種腫瘤,其致瘤作用主要通過其早期區(qū)域基因編碼產(chǎn)物大T抗原而實現(xiàn)。SV40T支持病毒的復(fù)制,可與眾多腫瘤抑制蛋白如Rb和p53結(jié)合,使其喪失功能,致使細(xì)胞分裂加速,形成腫瘤。 本研究中,我們設(shè)計了針對病毒SV40T抗原編碼區(qū)的三個不同位置處的21nt序列,并將已合成的三個序列插入到干涉表達(dá)載體,這種載體能產(chǎn)生針對SV40T抗原編碼區(qū)的小干涉RNA。然后將能產(chǎn)生小干涉RNA的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞,通過半定量RT-PCR、間接免疫熒光、流式細(xì)胞儀、Western—blot等方法觀測SV40T基因的抑制效果。實驗結(jié)果表明,SV40T特異性小干涉RNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無論從定性還是從定量上所測得的表達(dá)水平都明顯低于陰性對照,這揭示了小干涉RNA確實能引起SV40T基因的沉默。因而這一結(jié)果為研究利用RNA干涉進(jìn)行基因治療提供了基礎(chǔ)。 我們利用經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染驗證有效的小干涉表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)線性化后采用受精卵顯微注射技術(shù)成功獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠,此轉(zhuǎn)基因小鼠模型可通過生殖器將目的基因穩(wěn)定遺傳給后代。通過對轉(zhuǎn)基因小鼠后代的體內(nèi)表達(dá)檢測,證實目的基因在動物體內(nèi)的大部分組織都有表達(dá)。此轉(zhuǎn)基因小鼠模型的RNA干涉表達(dá)系統(tǒng)研究平臺的成功建立,為進(jìn)一步探討SV40T的致瘤作用創(chuàng)造丁條件,為研究SV40T與其它相關(guān)基因的相互作用提供了前提和基礎(chǔ)。
[Abstract]:Since it was discovered that double-stranded 21-base small interfering RNA (small interfering RNA,siRNA can induce specific gene silence, double-stranded RNA (double-strand RNA,dsRNA)-mediated RNA interference (RNA interference, RNAi has been widely used in inhibiting gene expression. At present, the widely used method to synthesize RNA transfected cells in vitro has the disadvantages of high synthesis cost, low transfection efficiency, and can not continue to play a role, and so on. The expression vector of siRNA was constructed and transfected into intracellular transcribed cells to form a large number of small hairpin RNA (short hairpin RNA,shRNA, and these shRNA specifically inhibited the expression of the gene. Simian virus SV40 can induce many kinds of tumors, and its tumorigenicity is mainly achieved by large T antigen, which is encoded by its early region gene. SV40T supports the replication of SV40T, which can bind to many tumor suppressor proteins such as Rb and p53. Causes it to lose its function, causes the cell division to accelerate, forms the tumor. In this study, we designed the 21nt sequences at three different positions in the coding region of viral SV40T antigen, and inserted the synthesized three sequences into the interference expression vector. This vector can produce small interference RNA. targeting the coding region of SV40T antigen. Then the plasmid which could produce small interference RNA was transiently transfected into COS-1 cells. The inhibitory effect of SV40T gene was observed by semi-quantitative RT-PCR, indirect immunofluorescence, flow cytometry and Western-blot. The results showed that the expression level of SV40T-specific small interference RNA expression plasmid transfected cells was significantly lower than that of negative control both qualitatively and quantitatively, which indicated that small interference RNA could indeed induce the silencing of SV40T gene. This result provides a basis for the study of gene therapy using RNA interference. The transgenic mice were successfully obtained by linearization of the small interference expression plasmid, which was proved to be effective by cell transfection, and then the transgenic mice were successfully obtained by microinjection of fertilized eggs. This transgenic mouse model can stably transmit the target gene to the offspring through the genitalia. It was confirmed that the target gene was expressed in most tissues of transgenic mice by detecting the expression of the target gene in vivo. The successful establishment of the research platform of RNA interference expression system in transgenic mice provides a prerequisite and basis for further study of the tumorigenicity of SV40T and the study of the interaction between SV40T and other related genes.
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R-332

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7 楊q，

本文編號：2466413