【摘要】： 第一篇日本血吸蟲童蟲蟲源性細胞免疫小鼠誘生的保護性效果 【目的】在前期研究中發(fā)現(xiàn)，用日本血吸蟲(Sj)童蟲的蟲源性活細胞可誘導小鼠產生較明顯的抗攻擊感染保護性免疫。本研究目的是為了進一步確認其免疫效果；比較童蟲細胞和成蟲細胞，死細胞與活細胞誘導宿主所產生的保護性效果差異及其免疫應答特點；探索最佳的免疫次數(shù)�！痉椒ā縎．j尾蚴感染小鼠獲得蟲體。胰酶消化法制備蟲源性細胞。臺盼藍染色檢測細胞活率�；罴毎�(jīng)-20℃凍融后定為死細胞。PCR擴增鑒定血吸蟲蟲源性細胞的種屬特異性并檢測細胞的純度。本研究設計了兩個實驗方案。在實驗一中，53只昆明小鼠被分成4組，即對照組10只、18天童蟲活細胞(LLC)免疫組18只、18天童蟲死細胞(DLC)免疫組13只和42天成蟲死細胞(DAC)免疫組11只。每兩周分別用各免疫原對小鼠作皮下注射，共4次。于末次免疫后1周用30±1 S．j尾蚴對小鼠進行攻擊感染。感染后第42天剖殺沖蟲，觀察結果。根據(jù)實驗1結果，LLC是誘導小鼠產生最佳保護性效果的免疫原，因此，在實驗二中選擇了LLC對昆明小鼠作不同次數(shù)免疫，比較所誘導產生的保護性免疫，探索最佳免疫次數(shù)。28只小鼠隨機分為4組：免疫1次組(V1)、2次組(V2)和3次組(V3)及對照組(Co)。于末次免疫后第2周用30±1 S．j尾蚴進行攻擊感染。感染后第45天解剖小鼠沖蟲。保護性效果的觀察指標包括：計數(shù)蟲荷及卵荷；測量蟲體長度和肝組織內蟲卵肉芽腫面積；對蟲卵肉芽腫進行組織病理學觀察。免疫學觀察指標包括：ELISA檢測免疫前后不同時點鼠血清中特異性總抗體(IgG+A+M)和IgG亞類抗體水平的動態(tài)變化；用SDS-PAGE及Western-blot對蟲體與細胞的成分差異及免疫特性差異進行比較分析�！窘Y果】Sj童蟲源性細胞形態(tài)和大小不一，活率在80％以上。經(jīng)PCR鑒定，細胞具有日本血吸蟲種屬特異性且無鼠源性宿主成分。免疫組與對照組的保護性指標比較顯示：在實驗一中，LLC，DLC和DAC組的減蟲率分別為65.1％，54.5％和-2.4％，減卵率分別為76.5％，66.9％和-10.3％；在實驗二中，用LLC免疫鼠2次和3次可分別獲得64.5％和62.1％的減蟲率及66.2％和66.1％的減卵率；此外，在實驗2中，攻擊后45天從V2和V3組小鼠體內所獲得的蟲體長度明顯短于Co組的蟲體；LLC免疫鼠肝表面蟲卵結節(jié)明顯少于DLC和DAC免疫鼠及對照鼠的；V3小鼠肝蟲卵肉芽腫顯著小于其他3組的。免疫學觀察指標顯示：LLC，DLC和DAC均能誘導小鼠產生抗童蟲或成蟲細胞抗原的IgG+A+M，抗體滴度與免疫次數(shù)呈正相關；LLC組小鼠血清中IgG2a／IgG1的比值明顯高于DAC及對照組；SDS-PAGE與Western-blot的結果顯示，18天童蟲細胞蛋白區(qū)帶與全蟲蛋白有明顯差別，18天童蟲細胞制備物具有較強的抗原性，但與感染血清未見明顯識別條帶，童蟲細胞中分子量約為38kDa組分僅被細胞抗原免疫血清所識別�！窘Y論】本研究表明：來源于18天童蟲的活細胞可誘導昆明鼠產生較理想的免疫保護效果；免疫2次或3次的保護性效果無顯著差異；IgG亞類絕對水平增高及IgG2a／IgG1比值增高間接反映了Th1型免疫反應與保護性免疫呈正相關；用于免疫接種的細胞源于蟲體實質成分，其中38kDa組分可能是一種優(yōu)勢抗原分子，但對其性質與功能有待于進一步研究。 第二篇日本血吸蟲童蟲培養(yǎng)細胞免疫小鼠誘導的保護性效果 【目的】前文研究證明，日本血吸蟲(Sj)童蟲源性細胞免疫小鼠可獲得較為滿意的抗攻擊感染效果�；诒菊n題組在Sj細胞體外傳代培養(yǎng)技術突破，本研究擬用Sj體外培養(yǎng)細胞為免疫原，觀察其誘導昆明小鼠所產生的免疫保護性效果以及免疫應答類型，以探索研發(fā)此類疫苗的可能性�！痉椒ā揩@取Sj尾蚴感染小鼠后不同發(fā)育期蟲體，在無菌條件下制備蟲源性細胞，用PRIM-1640-40Sj特定培基進行體外原代和傳代培養(yǎng)。用臺盼藍染色鑒定細胞活率。PCR擴增鑒定傳代培養(yǎng)細胞的種屬特異性并檢測細胞的純度。通過兩組實驗觀察傳代培養(yǎng)細胞所誘導的保護性效果及免疫反應類型。在實驗一中，3組小鼠每組8只，按1次／兩周間隔經(jīng)腹腔分別注射生理鹽水(NSCo)，18天童蟲培養(yǎng)細胞(JC-18)及12天童蟲培養(yǎng)細胞(JC-12)，共進行3次免疫。末次接種后第2周用40±2尾／鼠的Sj尾蚴攻擊感染。感染后第42天剖殺沖蟲，觀察保護性效果。在實驗二中，根據(jù)實驗1結果(發(fā)現(xiàn)JC-12的保護效果優(yōu)于JC-18)，進一步比較了體外培養(yǎng)的12天童蟲細胞(JC-12)和30天成蟲細胞(AC-30)所誘導的免疫保護性差異。在本實驗中，設計了兩個接種途徑：腹膜內注射(ip)和腹股溝皮下注射(sc)。JCip，JCse，ACsc和ACip 4個免疫組，每組10只，按1次／兩周的接種間隔共免疫3次。10只對照組小鼠(Co)皮下注射D’hanks組。各組小鼠于末次免疫后第4周用30±1尾／鼠Sj尾蚴進行攻擊感染，感染后第40天剖殺沖蟲，觀察了所誘導的保護性效果及免疫應答類型。用SDS-PAGE和Western-blot對成蟲(AWA)，童蟲(JWA)和童蟲培養(yǎng)細胞(JCA)的蛋白組分進行了分析。用JC-12和AC-30免疫鼠及對照鼠的脾細胞和血清分別對預感染Sj尾蚴(50尾±5／鼠)后第5天的小鼠作腹腔注射1次(血清：0.2ml／鼠，脾細胞：4.5×10~6／鼠)，每組6只鼠。被動免疫后第35天剖殺沖蟲，觀察了所誘導的保護性效果及免疫反應類型。用免疫鼠脾細胞與Sj尾蚴于體外共同培養(yǎng)，觀察24h，48h和72h的蟲體死亡率。檢測經(jīng)相應抗原刺激后的免疫鼠和非免疫鼠脾細胞分泌的LI-4和IFN-γ水平�！窘Y果】經(jīng)體外傳代培養(yǎng)的JC-12，JC-18和AC-30的細胞形態(tài)呈大小不等的圓形或橢圓形，可見成對細胞分裂相。與對照組比較，在實驗一中，JC-12組和JC-18組小鼠分別獲得了36.52％和26.92％的減蟲率及47.07％和35.53％的減卵率。兩類細胞均誘導宿主產生高水平抗18天童蟲抗原的IgG抗體。在實驗二中，JCip，JCsc小鼠分別獲得了41.17％和56.87％的減蟲率及54.13％和66.87％的減卵率；而ACsc和ACip的減蟲率分別為-2.70％和-16.08％，肝卵減少率分別為-0.27％和-2.30％。兩組JC免疫鼠的肝表面卵結節(jié)及肝卵成熟率明顯降低。來自于JCsc小鼠體內的蟲體長度明顯短于來自于AC免疫鼠和對照組鼠。ELISA結果顯示：JC免疫誘導產生相對較高水平的特異性IgE，IgG和IgG2a抗體，并在其經(jīng)抗原刺激的脾細胞和血清中測出高水平的IFN-γ。AC-30免疫鼠盡管誘導產生了高水平的特異性抗體及IL-4，但并沒有誘導產生明顯的保護性效果。被動轉移實驗中，僅發(fā)現(xiàn)JC免疫鼠血清獲得部分保護性效果。體外殺傷實驗結果顯示，JC和AC免疫鼠脾細胞均具有部分殺尾蚴作用，但以JC組殺傷率較高。SDS-PAGE分析結果顯示，體外傳代培養(yǎng)的Jc-12與JWA在成分上有較大差異。【結論】用體外培養(yǎng)的童蟲細胞免疫昆明小鼠可誘導產生抗血吸蟲攻擊感染的保護性效果，但JC-18所誘生的免疫效果不如JC-12，提示可能越幼期的蟲體細胞誘生的保護性效果越好。與前文比較，18天童蟲蟲源性細胞免疫所獲得效果優(yōu)于18天童蟲培養(yǎng)細胞，其原因可能與實驗批間差異或與細胞經(jīng)培養(yǎng)后某些成分被丟失有關。實驗1和實驗2的免疫效果有明顯差異，這可能與免疫源制備的穩(wěn)定性或實驗批間差異有關。在有效免疫中，顯示出以Th1型為主的免疫應答機制，但結合體外試驗結果可發(fā)現(xiàn)，高水平的保護性效果可能與Th1型和Th2型協(xié)同免疫所發(fā)揮的作用相關。成蟲培養(yǎng)細胞不能誘生抗攻擊感染作用的原因以及早期童蟲細胞免疫接種的最佳方案還有待于進一步探索。 第三篇日本血吸蟲細胞型免疫原模擬表位的篩選及鑒定 【目的】根據(jù)前述研究中證明S.j童蟲細胞可在小鼠動物模型中誘導產生有效的抗感染免疫。本研究為了從分子水平了解此類免疫原的保護性機制，采用噬菌體展示技術對Sj童蟲細胞抗原模擬肽表位進行了免疫篩選與鑒定。【方法】S.j12天童蟲細胞經(jīng)體外培養(yǎng)至4代后，用其活細胞免疫接種昆明小鼠，收集經(jīng)保護性實驗證明有效的攻擊感染前免疫血清，用飽和硫酸胺沉淀法初純化IgG抗體(抗SjJC-12抗體)后對噬菌體隨機12肽庫進行免疫篩選。經(jīng)過4輪免疫淘洗，陽性克隆得到16250倍有效富集。從第4輪篩選結果中隨機挑選20個克隆，經(jīng)ELISA檢測鑒定出15個陽性克隆；通過DNA測序和生物信息學分析出12個不同序列的陽性克隆。將此12個克隆分別免疫小鼠制備抗血清。用ELISA鑒定12個克隆的免疫原性以及是否為血吸蟲細胞的免疫模擬表位。用8個含精氨酸殘基的克隆和4個不含精氨酸殘基的克隆分別對昆明鼠進行聯(lián)合免疫(1次／10d，共3次)，于末次免疫后兩周用24尾／鼠S.j尾蚴進行攻擊感染，觀察保護性效果。【結果】用抗SjJC-12IgG免疫篩選隨機12肽庫獲得12個不同序列陽性克隆。經(jīng)生物信息學分析與基因比對，僅發(fā)現(xiàn)與比目魚的一種分子有38％的同源，提示這些多肽可能是JC-12抗原決定簇空間構象的模擬表位。ELISA檢測顯示：JC-12抗血清與12個克隆中11個發(fā)生反應，其中的clone-6不與JC-12免疫血清及JWA-12發(fā)生免疫反應，同時也不能誘導宿主產生抗體應答，提示該克隆所含序列與JC-12的抗原決定簇表位無關；12個克隆免疫鼠血清中有2個可誘導宿主產生強烈的抗體應答且可識別JC-12細胞抗原，其免疫血清也可識別JC-12細胞抗原及AWA-12可溶性抗原，提示這兩個克隆為JC-12抗原模擬表位，，具有進一步研究價值；兩組多克隆聯(lián)合免疫鼠血清均可識別JC-12抗原。含精氨酸殘基和不含精氨酸殘基的噬菌體克隆分別對小鼠作聯(lián)合免疫，抗攻擊感染實驗正在觀察中�！窘Y論】用抗JC-12抗體對噬菌體隨機12肽庫進行免疫篩選得到12個不同序列的克隆(含精氨酸殘基的8個)；經(jīng)鑒定顯示，有11個免疫宿主產生抗體應答，用JWA檢出10個克隆免疫血清呈陽性反應，其中兩個克隆具有進一步研究的價值。
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【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R382

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 劉彥;日本血吸蟲脫尾活童蟲表膜結合肽的親和篩選與功能鑒定[D];中南大學;2011年

相關碩士學位論文 前2條

1 喻容;日本血吸蟲童蟲細胞型免疫原的確認與免疫調節(jié)劑聯(lián)用抗感染效果觀察[D];中南大學;2008年

2 李艷琴;日本血吸蟲童蟲細胞免疫原及其模擬表位免疫學特性的研究[D];中南大學;2008年

本文編號：2448664