【摘要】： 【研究背景】 腎上腺髓質素(Adrenomedullin，ADM)最初是從人嗜鉻細胞瘤中分離出來的一種血管舒張肽，它具有包括舒張血管、利尿、抑制醛固酮分泌等在內的多種生物學效應。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，它具有抗凝活性，對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的感染性休克具有抵抗作用，然而，目前關于ADM抵抗感染性休克的機制尚未完全明確。感染性休克最常見的并發(fā)癥是彌散性血管內凝血(Disseminatedintravascular coagulation，DIC)。LPS可以通過組織因子(Tissue factor，TF)／因子Ⅶa(FⅦa)依賴的凝血途徑誘發(fā)DIC，，是感染性休克發(fā)生DIC的主要激活物。而ADM的抗凝活性是否有助于其對感染性休克的抵抗作用并不清楚，本研究旨在觀察ADM對LPS抑制的人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)組織因子途徑抑制物(Tissue factor pathway inhibitor，TFPI)(機體內的主要抗凝因子)表達的作用，并進一步闡明這種效應的分子機制。 【研究內容與方法】 本研究以體外原代培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)作為靶細胞，主要采用下述實驗方法進行了4個方面的研究： 一．ADM和／或LPS對HUVECs TFPI基因表達的影響 1．HUVECs分離、培養(yǎng)及鑒定； 2．采用發(fā)色底物法檢測HUVECs培養(yǎng)液中TFPI的蛋白活性，選擇ADM、LPS的最佳作用時間和濃度，觀察ADM在LPS存在條件下對HUVECs TFPI表達活性的影響； 3．應用RT-PCR技術分析ADM在LPS存在條件下對HUVECs TFPI mRNA表達水平的影響。 二．ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI基因表達的信號轉導途徑 1．采用促分裂原活化蛋白激酶激酶MAPKK (Mitogen-activated protein kinasekinase)特異性抑制劑PD98059觀察MAPK途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的信號轉導作用； 2．采用蛋白激酶C (Protein kinase C，PKC)抑制劑H7和Staurosporine觀察PKC途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的信號轉導作用； 3．采用cAMP抑制劑Rp-isomer-8-bromo-cAMP(簡稱Rp-cAMP)及其類似物8-bromo-cAMP觀察cAMP途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的信號轉導作用； 4．采用激光共聚焦顯微鏡技術(Laser-scanning confocal microscope)，觀察在ADM、LPS作用下單個HUVEC胞內鈣離子水平的變化，并輔以鈣離子拮抗劑Amlodipine，探討鈣離子信號途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達中的作用。 三．核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc在HUVECs TFPI基因轉錄調控中的作用 1．應用EMSA和超遷移(Super Shift)實驗，觀察ADM和／或LPS對TFPI基因表達相關核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc與其相應的順式作用元件結合活性的影響； 2．采用Western Blot雜交技術，觀察ADM和／或LPS對TFPI基因表達相關的核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc水平的影響。 四．TFPI基因5’上游不同長度啟動子區(qū)中GATA-2、SP1和c-Myc調節(jié)元件在HUVECs TFPI基因轉錄調控中的作用 1．采用PCR和基因重組技術，構建含人TFPI基因5’上游不同長度調控序列的熒光素酶報告基因質粒； 2．應用真核基因轉染技術，分析TFPI基因5’上游不同長度調控序列在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因轉錄中的調控作用； 3．采用重疊延伸特異位點誘變法，構建含人TFPI基因5’上游-1247bp至-381bp序列之間GATA-2和SP1順式作用元件定點突變序列的熒光素酶報告基因質粒； 4．應用真核基因轉染技術，分析TFPI基因5’上游GATA-2和SP1順式作用元件在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因轉錄中的作用。 【研究結果】 1．本研究中，ADM呈濃度和時間依賴性地誘導HUVECs中TFPI的蛋白活性和mRNA的表達，LPS的作用則相反，呈劑量依賴性地抑制HUVECs TFPI的蛋白表達，ADM可以拮抗LPS所致TFPI表達的降低。 2．MAPKK抑制劑PD98059以及cAMP抑制劑Rp-cAMP均顯著抑制ADM對LPS影響TFPI表達的拮抗作用；cAMP類似物8-bromo-cAMP可直接上調LPS抑制的TFPI的表達。 3．PKC抑制劑H7和Staurosporine對ADM拮抗LPS抑制TFPI表達的作用無顯著影響。 4．激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示，ADM使單個HUVEC胞內游離鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)緩慢平穩(wěn)地下降，而LPS可使胞內游離鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)迅速短暫地增加，預先給與HUVEC ADM后，LPS所致鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)的增加程度和速度顯著下降；鈣離子抑制劑Amlodipine可上調LPS所致TFPI表達的下降。 5．EMSA和Super Shift實驗證實，TFPI表達相關的核轉錄因子GATA-2、SP1和c-Myc可以與其相應的GATA-2、SP1和c-Myc調節(jié)元件發(fā)生特異性結合；在ADM作用下，核轉錄因子GATA-2和SP1與其相應調節(jié)元件的結合活性增加，LPS則使其結合活性下降，ADM對LPS所致結合活性的下降具有拮抗作用。核轉錄因子c-Myc與其調節(jié)元件的結合活性則無顯著變化。 6．Western Blot雜交結果顯示，ADM可顯著增加HUVECs胞內核轉錄因子GATA-2、SP1的蛋白含量，相反，LPS則降低GATA-2和SP1的蛋白含量，ADM可拮抗LPS的作用；核轉錄因子c-Myc的蛋白含量則無顯著變化。 7．瞬時轉染分析實驗結果顯示，TFPI基因5’上游啟動子區(qū)-1247bp和-381bp之間的序列在ADM和／或LPS調節(jié)熒光素酶的表達中具有重要作用，此間序列內含有3個GATA-2和1個SP1調節(jié)元件。 8．定點突變實驗結果顯示，上述3個GATA-2和1個SP1調節(jié)元件的突變均使LPS抑制的熒光素酶表達活性增加，ADM對LPS的拮抗作用也下降；此外，GATA-2調控序列的突變可使HUVECs基礎熒光素酶表達活性下降，而SP1的突變則對熒光素酶的基礎表達活性無明顯影響。 【研究結論】 本研究結果表明，ADM可以通過cAMP、MAPK和鈣離子信號途徑拮抗LPS對HUVECs TFPI表達的下調。核轉錄因子GATA-2和SP1以及TFPI基因5’上游啟動子區(qū)-1247bp至-381bp之間相應的GATA-2和SP1調節(jié)元件在TFPI的調節(jié)性表達中起著重要作用。本研究對ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI表達效應，以及TFPI表達調控機制的闡明有助于通過應用ADM或干涉TFPI的基因表達途徑改善膿毒血癥、感染性休克等嚴重炎癥性疾病的凝血狀態(tài)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 王虹,吳玉斌,李玉杰,杜秀華;地塞米松對內毒素誘導新生鼠心肌cAMP、cGMP及形態(tài)學的影響[J];新生兒科雜志;2002年05期

2 陳靜炯,龔永生,徐雅琴,許松,柴三葆,龐永正,唐朝樞;脂多糖刺激人血管內皮細胞分泌內皮素和腎上腺髓質素及其機制研究[J];中國病理生理雜志;2001年05期

3 蒲傳強,郝延磊,田成林;TNF-α和LPS對體外培養(yǎng)血腦屏障內皮細胞胞漿內鈣離子濃度的影響[J];中國微循環(huán);2003年01期

本文編號：2447225