【摘要】： 【研究背景】 腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)最初是從人嗜鉻細(xì)胞瘤中分離出來(lái)的一種血管舒張肽，它具有包括舒張血管、利尿、抑制醛固酮分泌等在內(nèi)的多種生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，它具有抗凝活性，對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的感染性休克具有抵抗作用，然而，目前關(guān)于ADM抵抗感染性休克的機(jī)制尚未完全明確。感染性休克最常見的并發(fā)癥是彌散性血管內(nèi)凝血(Disseminatedintravascular coagulation，DIC)。LPS可以通過組織因子(Tissue factor，TF)／因子Ⅶa(FⅦa)依賴的凝血途徑誘發(fā)DIC，，是感染性休克發(fā)生DIC的主要激活物。而ADM的抗凝活性是否有助于其對(duì)感染性休克的抵抗作用并不清楚，本研究旨在觀察ADM對(duì)LPS抑制的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)組織因子途徑抑制物(Tissue factor pathway inhibitor，TFPI)(機(jī)體內(nèi)的主要抗凝因子)表達(dá)的作用，并進(jìn)一步闡明這種效應(yīng)的分子機(jī)制。 【研究?jī)?nèi)容與方法】 本研究以體外原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)作為靶細(xì)胞，主要采用下述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了4個(gè)方面的研究： 一．ADM和／或LPS對(duì)HUVECs TFPI基因表達(dá)的影響 1．HUVECs分離、培養(yǎng)及鑒定； 2．采用發(fā)色底物法檢測(cè)HUVECs培養(yǎng)液中TFPI的蛋白活性，選擇ADM、LPS的最佳作用時(shí)間和濃度，觀察ADM在LPS存在條件下對(duì)HUVECs TFPI表達(dá)活性的影響； 3．應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析ADM在LPS存在條件下對(duì)HUVECs TFPI mRNA表達(dá)水平的影響。 二．ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI基因表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 1．采用促分裂原活化蛋白激酶激酶MAPKK (Mitogen-activated protein kinasekinase)特異性抑制劑PD98059觀察MAPK途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用； 2．采用蛋白激酶C (Protein kinase C，PKC)抑制劑H7和Staurosporine觀察PKC途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用； 3．采用cAMP抑制劑Rp-isomer-8-bromo-cAMP(簡(jiǎn)稱Rp-cAMP)及其類似物8-bromo-cAMP觀察cAMP途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用； 4．采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(Laser-scanning confocal microscope)，觀察在ADM、LPS作用下單個(gè)HUVEC胞內(nèi)鈣離子水平的變化，并輔以鈣離子拮抗劑Amlodipine，探討鈣離子信號(hào)途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的作用。 三．核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc在HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用 1．應(yīng)用EMSA和超遷移(Super Shift)實(shí)驗(yàn)，觀察ADM和／或LPS對(duì)TFPI基因表達(dá)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc與其相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合活性的影響； 2．采用Western Blot雜交技術(shù)，觀察ADM和／或LPS對(duì)TFPI基因表達(dá)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc水平的影響。 四．TFPI基因5’上游不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子區(qū)中GATA-2、SP1和c-Myc調(diào)節(jié)元件在HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用 1．采用PCR和基因重組技術(shù)，構(gòu)建含人TFPI基因5’上游不同長(zhǎng)度調(diào)控序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒； 2．應(yīng)用真核基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析TFPI基因5’上游不同長(zhǎng)度調(diào)控序列在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用； 3．采用重疊延伸特異位點(diǎn)誘變法，構(gòu)建含人TFPI基因5’上游-1247bp至-381bp序列之間GATA-2和SP1順式作用元件定點(diǎn)突變序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒； 4．應(yīng)用真核基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析TFPI基因5’上游GATA-2和SP1順式作用元件在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄中的作用。 【研究結(jié)果】 1．本研究中，ADM呈濃度和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)HUVECs中TFPI的蛋白活性和mRNA的表達(dá)，LPS的作用則相反，呈劑量依賴性地抑制HUVECs TFPI的蛋白表達(dá)，ADM可以拮抗LPS所致TFPI表達(dá)的降低。 2．MAPKK抑制劑PD98059以及cAMP抑制劑Rp-cAMP均顯著抑制ADM對(duì)LPS影響TFPI表達(dá)的拮抗作用；cAMP類似物8-bromo-cAMP可直接上調(diào)LPS抑制的TFPI的表達(dá)。 3．PKC抑制劑H7和Staurosporine對(duì)ADM拮抗LPS抑制TFPI表達(dá)的作用無(wú)顯著影響。 4．激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示，ADM使單個(gè)HUVEC胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)緩慢平穩(wěn)地下降，而LPS可使胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)迅速短暫地增加，預(yù)先給與HUVEC ADM后，LPS所致鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)的增加程度和速度顯著下降；鈣離子抑制劑Amlodipine可上調(diào)LPS所致TFPI表達(dá)的下降。 5．EMSA和Super Shift實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TFPI表達(dá)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc可以與其相應(yīng)的GATA-2、SP1和c-Myc調(diào)節(jié)元件發(fā)生特異性結(jié)合；在ADM作用下，核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和SP1與其相應(yīng)調(diào)節(jié)元件的結(jié)合活性增加，LPS則使其結(jié)合活性下降，ADM對(duì)LPS所致結(jié)合活性的下降具有拮抗作用。核轉(zhuǎn)錄因子c-Myc與其調(diào)節(jié)元件的結(jié)合活性則無(wú)顯著變化。 6．Western Blot雜交結(jié)果顯示，ADM可顯著增加HUVECs胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1的蛋白含量，相反，LPS則降低GATA-2和SP1的蛋白含量，ADM可拮抗LPS的作用；核轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的蛋白含量則無(wú)顯著變化。 7．瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TFPI基因5’上游啟動(dòng)子區(qū)-1247bp和-381bp之間的序列在ADM和／或LPS調(diào)節(jié)熒光素酶的表達(dá)中具有重要作用，此間序列內(nèi)含有3個(gè)GATA-2和1個(gè)SP1調(diào)節(jié)元件。 8．定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述3個(gè)GATA-2和1個(gè)SP1調(diào)節(jié)元件的突變均使LPS抑制的熒光素酶表達(dá)活性增加，ADM對(duì)LPS的拮抗作用也下降；此外，GATA-2調(diào)控序列的突變可使HUVECs基礎(chǔ)熒光素酶表達(dá)活性下降，而SP1的突變則對(duì)熒光素酶的基礎(chǔ)表達(dá)活性無(wú)明顯影響。 【研究結(jié)論】 本研究結(jié)果表明，ADM可以通過cAMP、MAPK和鈣離子信號(hào)途徑拮抗LPS對(duì)HUVECs TFPI表達(dá)的下調(diào)。核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和SP1以及TFPI基因5’上游啟動(dòng)子區(qū)-1247bp至-381bp之間相應(yīng)的GATA-2和SP1調(diào)節(jié)元件在TFPI的調(diào)節(jié)性表達(dá)中起著重要作用。本研究對(duì)ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI表達(dá)效應(yīng)，以及TFPI表達(dá)調(diào)控機(jī)制的闡明有助于通過應(yīng)用ADM或干涉TFPI的基因表達(dá)途徑改善膿毒血癥、感染性休克等嚴(yán)重炎癥性疾病的凝血狀態(tài)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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1 王虹,吳玉斌,李玉杰,杜秀華;地塞米松對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)新生鼠心肌cAMP、cGMP及形態(tài)學(xué)的影響[J];新生兒科雜志;2002年05期

2 陳靜炯,龔永生,徐雅琴,許松,柴三葆,龐永正,唐朝樞;脂多糖刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌內(nèi)皮素和腎上腺髓質(zhì)素及其機(jī)制研究[J];中國(guó)病理生理雜志;2001年05期

3 蒲傳強(qiáng),郝延磊,田成林;TNF-α和LPS對(duì)體外培養(yǎng)血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度的影響[J];中國(guó)微循環(huán);2003年01期

本文編號(hào)：2447225