【摘要】： 背景與目的：目前已經(jīng)確認幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)與上消化道疾病中的4中疾病密切相關(guān)：①慢性胃炎；②消化性潰瘍；③胃癌；④胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(MALT)。根據(jù)H．pylori是否含有細胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA)和空泡毒素基因(vacuolating cytotoxin gene A，VacA)將H．pylori分為Ⅰ型菌株(CagA~+、VacA~+)和Ⅱ型菌株(CagA~-、VacA~-)。Ⅰ型菌株含有一個約40kb的特殊基因片段，因其編碼CagA等毒力因子而被稱為CagA毒力島。1997年到1998年，2個H．pyloriⅠ型菌株26695菌株和J99菌株的基因組被完全測序，并比較兩種菌株，使人們能全面了解HpⅠ型菌株的基因組結(jié)構(gòu)和主要特征。鑒于Ⅰ型菌株現(xiàn)被認為是消化性潰瘍和胃腫瘤的重要原因，因此CagA基因的研究成為H．pylori研究中的熱點。目前，治療H．pylori感染主要應(yīng)用抗生素和質(zhì)子泵抑制劑，但抗生素的廣泛應(yīng)用會導致Hp耐藥性的不斷增加，復發(fā)率高。因此，防治H．pylori感染非常必要。但目前尚未研制出有效的實用的HpⅠ型菌株疫苗。為此，本研究擬用分子生物學技術(shù)，并構(gòu)建含CagA的綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C3-CagA，并在真核細胞中表達，為H．pylori重組疫苗的研制提供備選抗原，也為H．pyloriⅠ型菌株的鑒定試劑盒提供抗原參考。 方法：根據(jù)GenBank收錄的Hp CagA序列，設(shè)計PCR引物，并在每條引物前分別添加內(nèi)切酶位點。通過PCR擴增出幽門螺桿菌細胞株中CagA基因片段，運用分子克隆的經(jīng)典方法，用pGEM-T easy質(zhì)粒載體攜帶該基因轉(zhuǎn)化工程菌JM109，繼而通過藍白篩選出陽性菌落并對該基因測序，將其結(jié)果與已公布的CagA基因序列比對。測序結(jié)果正確后再將CagA基因從pGEM-T-CagA重組體中提取，用質(zhì)粒pEGFP-C3攜帶該基因轉(zhuǎn)化宿主菌JM109，通過卡那霉素抗性篩選出陽性克隆pEGFP-C3-CagA。而后用脂質(zhì)體法將pEGFP-C3-CagA轉(zhuǎn)染入胃癌細胞株BGC823中，用熒光顯微鏡觀察其在真核細胞中的表達。 結(jié)果： 1．目的基因擴增：從H．pylori菌株中，利用PCR擴增得到CagA目的基因(507bp)，，加上兩端內(nèi)切酶位點共523bp。 2．正確構(gòu)建pGEM-T-CagA原核重組質(zhì)粒，目的基因的測序結(jié)果與GenBank公布的同源性達100％。 3．成功構(gòu)建出綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C3-CagA，轉(zhuǎn)染后在真核細胞中廣泛表達。 結(jié)論： 1．成功獲得幽門螺桿菌菌株CagA保守區(qū)基因序列。 2．正確構(gòu)建綠色熒光蛋白表達載體pEGFP-C3-CagA，并在胃癌細胞株BGC823中獲得了表達。 3．建立了CagA的真核表達系統(tǒng)，為H．pylori重組疫苗的研制提供了備選抗原，同時也為H．pyloriⅠ型菌株的鑒定試劑盒提供抗原參考。
[Abstract]:Background & objective: Helicobacter pylori (Helicobacter pylori,H.pylori) has been confirmed to be closely associated with 4 intermediate diseases in upper gastrointestinal diseases: (1) chronic gastritis; (2) peptic ulcer; (3) gastric cancer; (4) gastric mucosal associated lymphoid tissue lymphoma (MALT).) According to whether H.pylori contains cytotoxin associated gene A (cytotoxin-associated gene A) and vacuolating toxin gene (vacuolating cytotoxin gene A (Vaca), H.pylori is divided into CagA~ (VacA~) and type 鈪

本文編號：2446426