【摘要】： 目的:外周組織轉出的膽固醇主要經(jīng)高密度脂蛋白(HDL)逆向轉運至肝臟代謝。HDL前體是由肝細胞合成的,肝細胞中的ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)表達增加時,HDL前體也隨之增加。HDL前體入血后募集外周組織游離的膽固醇,并在血漿卵磷脂膽固醇脂酰轉移酶(LCAT)作用下生成膽固醇酯,HDL成為成熟的HDL,成熟的HDL又被肝細胞膜上的HDL受體清道夫受體BI(SR-BI)識別結合后,將膽固醇轉入肝細胞,發(fā)揮其特定的生物功能或轉化成膽汁酸,隨膽汁排出體外。膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成的限速酶,其活性的大小決定了膽汁酸合成的速度。研究報道,糖尿病時血總膽固醇升高,進入肝臟的膽固醇也隨之增加,同時CYP7A1酶活性升高。那么,糖尿病肝臟膽固醇的攝入增多是否與肝臟ABCA1和SR-BI基因表達有關呢?糖尿病狀態(tài)肝CYP7A1酶活性升高是不是因CYP7A1表達增加而引起的呢?未見報道。 細胞內脂肪酸代謝主要由過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)調節(jié),膽固醇代謝主要由肝X受體α(LXRα)調節(jié)。兩個核受體對脂肪酸和膽固醇代謝調節(jié)存在交互作。糖尿病狀態(tài),脂肪動員加強,增高的游離脂肪酸可激活肝PPARα。那么,糖尿病狀態(tài)PPARα被脂肪酸激活時,肝中LXRα是否也被激活?肝膽固醇相關基因的表達會不會隨著LXRα的激活而改變呢?未見報道。 非諾貝特是PPARα的人工合成配體,是臨床常用的降脂藥,它除了通過激活PPARα促進與脂肪酸分解代謝有關的酶基因表達,加強脂肪酸的分解達到降血脂的目的外,也有輕微的降血總膽固醇的作用。糖尿病時它是否通過激活PPARα進而激活LXRα,使其下游基因表達增加,從而調節(jié)膽固醇代謝,使血總膽固醇和肝膽固醇水平下降從而改善肝細胞的結構與功能?未見報道。 為此,本研究一方面以鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠為實驗對象,通過肝組織形態(tài)學直接觀察,和血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的測定,確定糖尿病大鼠肝功能損傷的同時,觀測糖尿病大鼠肝膽固醇含量;用RT-PCR方法,測定肝組織中PPARα、脂酰CoA氧化酶(ACOX1)以及LXRα、ABCA1、SR-BI、CYP7A1等與膽固醇代謝有關的基因表達情況;另一方面,觀察PPARα人工合成的激活配體,降脂藥-非諾貝特,對上述各項指標的影響,了解糖尿病肝膽固醇代謝情況,進一步探討糖尿病肝臟脂代謝紊亂的分子機理,深化對糖尿病脂代謝紊亂的認識。方法: 1動物分組及取材 選用成年200-250g雄性清潔級Wistar大鼠,隨機分為:正常對照組(CON)、糖尿病組(DM)、糖尿病+非諾貝特組(DM+F)、正常對照+非諾貝特組(CON+F)。正常大鼠一次性腹腔注射2% STZ誘導糖尿病發(fā)生。CON+F組和DM+F組在糖尿病大鼠模型建立后4周末,分別用生理鹽水和非諾貝特連續(xù)兩周給正常和STZ鼠灌胃(100mg/kg/day)。頸動脈采空腹血,血清用于血糖、血脂、血膽汁酸、血谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的測定。肝臟用于組織切片、RNA及脂質提取。 2光鏡觀察組織病理變化 按常規(guī)方法將肝組織用甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色后,光鏡觀察。 3肝臟總脂提取 參照文獻[12]提取肝臟總脂,用于膽固醇測定。 4血糖、血脂、血膽汁酸、血ALT、血AST、肝膽固醇的測定 上述指標用Olympus Au2700型全自動生化分析儀測定。5肝組織有關基因mRNA相對表達量的測定 用Trizol法提取總RNA。以GAPDH作為內參,用RT-PCR法測定PPARα、ACOX1、LXRα、ABCA1、SR-BI及CYP7A1 mRNA的相對表達量。 結果: 1正常對照和糖尿病組各項指標變化 1.1血AST/ALT和肝組織形態(tài)結構變化:糖尿病組血AST/ALT明顯下降(1.776±0.279 vs 2.261±0.445, p0.01);糖尿病組肝細胞排列紊亂,放射狀結構消失,血竇擴張。表明,糖尿病時肝細胞結構異常,肝功能受損。 1.2血脂變化:糖尿病時,血總膽固醇(1.870±0.180mmol/L vs 1.359±0.197mmol/L, p0.01)、血HDL-C(1.308±0.188mmol/L vs 1.011±0.209mmol/L, p0.01 )、血膽汁酸(59.626±16.349μmol/L vs 9.334±2.011μmol/L, p0.01)、血甘油三酯(1.346±0.393mmol/L vs 0.651±0.130mmol/L, p0.01)都明顯升高。表明,糖尿病時膽固醇和甘油三酯代謝異常。 1.3肝膽固醇含量的變化:糖尿病組與正常對照組肝膽固醇含量區(qū)別( 32.974±5.526mmol/mg vs 31.977±4.782mmol/mg, p0.05)無統(tǒng)計學意義。 1.4肝基因表達結果 1.4.1肝PPARα、ACOX1 mRNA相對表達量的改變:糖尿病組和正常組相比,PPARαmRNA相對表達量(0.921±0.123 vs 0.621±0.132, p0.01 )以及ACOX1 mRNA相對表達量(0.801±0.128 vs 0.587±0.081, p0.01)都明顯升高。表明,糖尿病時,PPARα表達增加并且被激活。 1.4.2肝LXRα、ABCA1、SR-BI、CYP7A1 mRNA相對表達量的改變:糖尿病組和正常組相比,LXRα(1.216±0.128 vs 0.702±0.097, p0.01)、ABCA1(0.725±0.127 vs 0.177±0.042, p0.01),SR-BI(0.672±0.105 vs 0.220±0.040, p0.01)及CYP7A1(1.137±0.212 vs 0.697±0.141, p0.01)的mRNA相對表達均明顯升高。表明,糖尿病時肝PPARα表達增加的同時,調節(jié)膽固醇代謝的核受體LXRα的表達也協(xié)同增加。HDL前體形成增多,肝臟攝入HDL-C增加,膽汁酸生成增多,膽固醇的轉運、吸收和轉化增強。 2糖尿病+非諾貝特組和正常對照+非諾貝特組各項指標變化 2.1血AST/ALT和肝組織形態(tài)結構變化:糖尿病加藥組與糖尿病組(1.772±0.193 vs 1.776±0.279, p0.05)之間,正常加藥組與正常組(2.687±0.512 vs2.261±0.445, p0.05)之間大鼠血AST/ALT變化無統(tǒng)計學意義;糖尿病+非諾貝特組與糖尿病組相比以及正常對照+非諾貝特組與正常組相比,肝組織結構沒有明顯改變。表明,非諾貝特不改變大鼠肝組織結構和功能。 2.2血脂變化:除糖尿病加藥組大鼠血甘油三酯( 0.743±0.269mmol/L )明顯低于糖尿病組(1.346±0.393mmol/L, p0.01)外,兩組之間血總膽固醇(1.903±0.312mmol/L vs 1.870±0.180mmol/L, p0.05)、血HDL-C(1.332±0.249mmol/L vs 1.308±0.188mmol/L, p0.05)、血膽汁酸(56.671±29.694μmol/L vs 59.626±16.349μmol/L, p0.05)的變化均無統(tǒng)計學意義;正常加藥組和正常組相比,血總膽固醇( 0.979±0.156mmol/L vs 1.359±0.197mmol/L, p0.01 )、血HDL-C ( 0.566±0.111mmol/L vs 1.011±0.209mmol/L, p0.01 )明顯下降,血總膽汁酸(30.880±9.226μmol/L vs 9.334±2.011μmol/L, p0.01)明顯升高,血甘油三酯(0.757±0.108mmol/L vs 0.651±0.130mmol/L, p0.05)變化無統(tǒng)計學意義。表明,非諾貝特降低正常鼠血總膽固醇,但不降低糖尿病鼠血總膽固醇;非諾貝特不降低正常鼠血甘油三酯,但降低糖尿病鼠血甘油三酯;糖尿病鼠和正常鼠的脂代謝受非諾貝特的影響不同。 2.3肝膽固醇含量的變化:糖尿病加藥組肝膽固醇含量(26.167±2.937mmol/mg)明顯低于糖尿病組(32.974±5.526 mmol/mg, p0.01 );正常加藥組肝膽固醇含量( 24.417±1.429mmol/mg )明顯低于正常組(31.977±4.782mmol/mg, p0.01)。表明,非諾貝特能降低大鼠肝膽固醇水平。 2.4肝基因表達結果 2.4.1肝PPARα,ACOX1 mRNA相對表達量的改變:糖尿病加藥組與糖尿病組(0.784±0.138 vs 0.921±0.123, p0.05)以及正常加藥組與正常組(0.651±0.133 vs 0.621±0.132, p0.05)之間PPARαmRNA相對表達量變化均無統(tǒng)計學意義。糖尿病加藥組ACOX1 mRNA相對表達量(1.253±0.125)明顯高于糖尿病組(0.801±0.128, p0.01),正常加藥組ACOX1 mRNA相對表達量(1.273±0.194)明顯高于正常組(0.587±0.081, p0.01)。表明,非諾貝特激活了正常大鼠和糖尿病大鼠肝PPARα。 2.4.2肝LXRα、ABCA1、SR-BI、CYP7A1 mRNA相對表達量的改變:糖尿病加藥組與糖尿病組之間,LXRα(1.090±0.087 vs 1.216±0.128, p0.05)、ABCA1(0.809±0.050 vs 0.725±0.127, p0.05)和SR-BI(0.554±0.081 vs 0.672±0.105, p0.05)的mRNA相對表達量變化均無統(tǒng)計學意義;糖尿病加藥組CYP7A1 mRNA相對表達量(1.399±0.149)明顯高于糖尿病組(1.137±0.212, p0.01)。正常加藥組和正常組相比,LXRα(0.944±0.189 vs 0.702±0.097, p0.01)、ABCA1(0.807±0.131 vs 0.177±0.042, p0.01)、SR-BI(0.540±0.140 vs 0.220±0.040, p0.01)以及CYP7A1 (1.038±0.116 vs 0.697±0.141, p0.01)的mRNA相對表達量均明顯升高。表明,非諾貝特對糖尿病鼠和正常鼠基因表達的影響不同。 結論: 1糖尿病時,大鼠肝PPARα的激活伴隨LXRα的激活。糖尿病肝脂肪酸代紊亂時,與膽固醇代謝有關的基因表達也出現(xiàn)異常。 2非諾貝特對糖尿病鼠肝膽固醇代謝相關基因mRNA表達影響不同于正常鼠。在我們實驗條件下,它雖然可以降低糖尿病鼠肝膽固醇水平,但不能降低糖尿病鼠血總膽固醇。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 王倩;2型糖尿病性腹瀉與腸神經(jīng)系統(tǒng)病變關系的研究[D];山東大學;2011年

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本文編號：2444577