【摘要】： 結核病是由結核分枝桿菌引起的一種嚴重的人類傳染性疾病。目前全球人口中大約1/3的人已感染結核分枝桿菌,每年約有300萬人死于結核。近年來,耐藥結核桿菌的出現(xiàn),使尋找新型抗結核桿菌的藥物勢在必行。2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑用于合成異戊酰焦磷酸(IPP)或其異構物,二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP),這兩者是胞內重要化合物類異戊二烯合成的共同前體。MEP途徑是細菌生長所必需而人類不存在的代謝途徑,因此成為篩選新型抗菌藥物的潛在靶標。 本文對結核分枝桿菌基因組中編碼MEP途徑的第三個酶,4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇(CDP-ME)合成酶基因(ispD/Rv3582c)進行克隆,并表達純化了該蛋白(MtIspD)。通過HPLC和非變性膠電泳分析,表明具生物活性的MtIspD蛋白為同二聚體。酶活分析顯示MtIspD是金屬酶,Mg~(2+)為最適二價金屬離子。MtIspD對輔因子底物特異性高,CTP為最適底物。CTP和MEP的Km值分別為92μM和43μM,Vmax為7.8μmol.min~(-1).mg~(-1),酶單體的轉換數(shù)為3.4 S~(-1)。MtIspD酶熱穩(wěn)定性差,通過圓二色儀分析不同溫度下的二級結構和三級結構,顯示三維構象隨溫度的變化與酶活的喪失密切相關。對MtIspD模建結構與大腸桿菌結晶結構比較分析,顯示MtIspD酶活性位點保守,酶單體β臂的相互作用對二聚體形成和酶活性中心形成起關鍵作用。進一步對酶活中心的三個保守堿性氨基酸和86位蘇氨酸定點突變分析,結果顯示K27A,R157A和K215A不僅使酶失活,而且影響蛋白二級結構和三維構象;86位蘇氨酸定點突變(T86S和T86A)說明86位氨基酸羥基對MtIspD酶活有重要作用。我們對MtIspD酶活和結構的研究表明IspD蛋白家族比較保守,可以以IspD酶活中心篩選和設計廣譜抗菌素,并且針對同時參與活性位點和二聚體形成的保守堿基似乎對抑制酶活更為有效。我們的研究為以該酶作為抗結核桿菌藥物靶標篩選抑制劑和新型藥物奠定了基礎。 結核分枝桿菌基因組中ispE基因(Rv1011)編碼MEP途徑的第四個酶4-二磷酸胞苷2-C-甲基-D赤蘚糖醇(CDP-ME)激酶,由于ispE基因單獨分布,但編碼蛋白必須與催化上下游步驟的單功能IspD/IspF或雙功能蛋白IspDF相互作用,才能使MEP途徑進行,所以在MEP途徑中起關鍵作用,因而是重要的抗結核桿菌藥物靶標。然而MEP途徑作為候選藥物靶標,目前仍無亞細胞定位的實驗報道。本文將ispE基因克隆到pET28a載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中表達重組蛋白(MtIspE),用Ni-NTA柱親和層析純化重組蛋白。其純度和分子量分別通過SDS-PAGE和高效液相-質譜測定。利用圓二色儀對MtIspE進行二級結構測定,該重組蛋白中含有的α螺旋,β折疊,β轉角和無規(guī)則卷曲分別為36.3%,26.9%,11.8%和25.1%。MtIspE酶活分析首先需制備CDP-ME底物,由上游重組蛋白MtIspD催化CTP和MEP形成,經(jīng)高效液相/質譜聯(lián)用純化和分析產(chǎn)物,證實獲得有效的CDP-ME。酶活測定雙底物ATP和CDP-ME的Km值,分別為213μM and 317μM,Vmax為0.413μmol.min~(-1).mg~(-1),酶單體的轉換數(shù)為0.23 S~(-1)。我們用MtIspE免疫大白兔獲得高滴度的多克隆抗體,通過RT-PCR和蛋白印跡分析,說明結核分枝桿菌對數(shù)生長期確實表達IspE蛋白,該蛋白主要在結核分枝桿菌胞漿發(fā)揮最用。通過對MtIspE酶學分析和在結核分枝桿菌亞細胞定位的研究,將為篩選和修飾抗MtIspE的新型抗結核藥物有一定的幫助。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2441973