【摘要】：乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)(簡稱乙腦)，是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus JEV)引起的一種嚴重危害人畜健康的蟲媒病毒性疾病。該病對人類危害巨大，約三分之一的患者會死亡，存活的患者中有40％-70％會留下神經(jīng)后遺癥。乙腦也是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，該病感染豬造成的主要經(jīng)濟損失是導致嚴重的繁殖障礙性疾病。目前對于該病還沒有有效的治療方法。RNAi是機體本身存在的天然抗病毒機制，為人們預防和治療病毒感染開啟了希望之門。本實驗利用RNAi技術(shù)，從抑制病毒復制的角度，為乙腦的免疫預防開辟新途徑。同時，本研究還開展了乙腦病毒主要免疫原性基因E和NS1的“自殺性”DNA疫苗研究，并在此基礎上探討了牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)的VP22蛋白對乙腦病毒“自殺性”DNA疫苗免疫效果的影響。主要研究內(nèi)容如下： 1．siRNAs對乙腦病毒NS1基因表達的抑制 以乙腦病毒的NS1基因為靶基因，設計合成了4個siRNA序列，并構(gòu)建了各自的表達質(zhì)粒(pS-NS1A，pS-NS1B，pS-NS1C，pS-NS1D)；構(gòu)建了NS1基因與EGFP融合的真核表達質(zhì)粒(pCDNS1-EGFP)，并實現(xiàn)了二者在Vero細胞和BHK-21細胞中的融合表達；將siRNA表達質(zhì)粒與pCDNS1-EGFP共轉(zhuǎn)染細胞后，經(jīng)熒光觀察、流式細胞儀檢測、Western blot、RT-PCR等方法證實：在4個siRNAs序列中，pS-NS1A的抑制作用不明顯，而pS-NS1B、pS-NS1C、pS-NS1D對NS1基因表達有顯著的特異性抑制作用，其中pS-NS1C和pS-NS1D抑制效果達到80％—90％。 2．siRNAs對乙腦病毒復制的抑制 將上述構(gòu)建的4個siRNAs表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，24小時后感染130PFU乙腦病毒，經(jīng)間接免疫熒光觀察、Western blot、空斑形成實驗、RT-PCR等方法證實：在4個siRNAs序列中，pS-NS1A的抑制作用不明顯，pS-NS1B，，pS-NS1C，pS-NS1D對乙腦病毒復制有顯著的特異性抑制作用，其中pS-NS1C，pS-NS1D抑制效果達到79％—86％。 3．乙腦病毒E、NS1基因“自殺性”DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的免疫效果比較 將乙腦病毒E和NS1基因分別插入到“自殺性”DNA疫苗載體—PSCAI(pS)，分別構(gòu)建了pSNS1、pSE兩種“自殺性”DNA疫苗。在此基礎上，將BHV-1的VP22蛋白基因分別插入到NS1、E基因的上游，使VP22與NS1、E基因融合表達，從而構(gòu)建了另兩種“自殺性”DNA疫苗：pSBNS1、pSBE。間接免疫熒光實驗證實所構(gòu)建的質(zhì)粒均在BHK-21細胞中獲得表達。小鼠的動物試驗表明：NS1基因的“自殺性”DNA疫苗可以誘導顯著高于常規(guī)DNA疫苗的ELISA抗體和細胞免疫水平；E基因的“自殺性”DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗相比，在誘導體液免疫方面沒有優(yōu)勢，
[Abstract]:Encephalitis B (Japanese encephalitis,JE) is an insect-borne disease caused by Japanese encephalitis virus (Japanese encephalitis virus JEV), which is harmful to the health of human and animal. The disease does great harm to humans, with about 1/3 of patients dying, and 40% and 70% of surviving patients with neurological sequelae. Japanese encephalitis (je) is one of the most important infectious diseases in pig industry. The main economic loss caused by the infection is serious reproductive disorders. RNAi is a natural antiviral mechanism which opens the door of hope for the prevention and treatment of viral infection. In this study, the RNAi technique was used to inhibit the replication of the virus and to open up a new way for the immunoprevention of Japanese encephalitis. At the same time, we also carried out the "suicide" DNA vaccine study of the major immunogenic genes E and NS1 of Japanese encephalitis virus (JEV). The effect of VP22 protein of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) on the immune response of Japanese encephalitis virus (JEV) suicide DNA vaccine was also studied. The main contents are as follows: four siRNA sequences were designed and synthesized by using the NS1 gene of Japanese encephalitis virus (JEV) as the target gene to inhibit the expression of NS1 gene in Japanese encephalitis virus (JEV) induced by 1.siRNAs. The expression plasmids (pS-NS1A,pS-NS1B,pS-NS1C,pS-NS1D) were constructed. The eukaryotic expression plasmid (pCDNS1-EGFP) of the fusion of NS1 gene and EGFP was constructed, and the fusion expression of the two genes in Vero cells and BHK-21 cells was realized. After co-transfection of siRNA expression plasmid with pCDNS1-EGFP, the results of fluorescence observation, flow cytometry and Western blot,RT-PCR showed that the inhibitory effect of pS-NS1A was not obvious in the four siRNAs sequences, while pS-NS1B,pS-NS1C, was not obvious. PS-NS1D significantly inhibited the expression of NS1 gene, and the inhibitory effect of pS-NS1C and pS-NS1D reached 80% and 90% respectively. 2.siRNAs inhibited the replication of Japanese encephalitis virus (JEV). The above four siRNAs expression plasmids were transfected into BHK-21 cells and infected with 130PFU je virus 24 hours later., Western blot, was observed by indirect immunofluorescence. Plaque formation test, RT-PCR and other methods confirmed that pS-NS1A had no obvious inhibitory effect on the replication of Japanese encephalitis virus (JEV) in the four siRNAs sequences, and pS-NS1B,pS-NS1C,pS-NS1D had a specific inhibitory effect on the replication of Japanese encephalitis virus (JEV). Among them, pS-NS1C, had a specific inhibitory effect. The inhibitory effect of pS-NS1D was 79% and 86% respectively. 3. Comparison of immune efficacy of Japanese encephalitis virus E, NS1 gene "suicide" DNA vaccine and conventional DNA vaccine to insert Japanese encephalitis virus E and NS1 genes into "suicide" DNA vaccine vector-PSCAI (pS), respectively. Two "suicide" DNA vaccines of pSNS1,pSE were constructed respectively. On this basis, the VP22 protein gene of BHV-1 was inserted into the upstream of NS1,E gene, and the fusion expression of VP22 and NS1,E gene was made. Two other "suicide" DNA vaccines, pSBNS1,pSBE., were constructed. Indirect immunofluorescence assay confirmed that the constructed plasmids were expressed in BHK-21 cells. The results of animal experiments in mice showed that the suicidal DNA vaccine of NS1 gene could induce significantly higher ELISA antibody and cellular immune level than that of conventional DNA vaccine. The "suicide" DNA vaccine of the E gene has no advantage in inducing humoral immunity compared with the conventional DNA vaccine.
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392;S852.5

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