【摘要】： 研究背景和目的 漢坦病毒(Hantavirus，HTVs)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，是一種分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒。病毒基因組由小(S)，中(M)，大(L)三個(gè)片段組成，分別編碼病毒的核衣殼蛋白(NP)，包膜糖蛋白前體以及RNA依賴的RNA聚合酶。包膜糖蛋白前體以共翻譯后切割的方式產(chǎn)生G1和G2糖蛋白，并經(jīng)由N-連接的糖基化修飾。漢灘病毒的包膜糖蛋白上共有五個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中四個(gè)位于G1上(N134，-235，-347，-399)，另一個(gè)位于G2上(N928)。通常N-連接的寡糖鏈可以通過多種方式影響蛋白質(zhì)的功能，包括促進(jìn)蛋白的正確折疊，保持蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性，防止蛋白酶的消化等。我國(guó)是漢坦病毒流行危害最嚴(yán)重的國(guó)家，全世界90％以上的腎綜合征出血熱(HFRS)的病例發(fā)生在我國(guó)。腎綜合征出血熱在我國(guó)主要是由漢灘病毒(HTNV)和漢城病毒(SEOV)兩型病毒引起的。因此我們選擇漢灘病毒A9株，84FLI株以及漢城病毒L99株作為研究對(duì)象。 病毒的包膜與宿主細(xì)胞膜的融合是包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞的第一步。正是這一膜融合的過程導(dǎo)致病毒的蛋白和基因組RNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而開始病毒的感染周期。包膜病毒不僅可以介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜之間的融合而且還可以介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間的融合。對(duì)其他包膜病毒的大量研究表明，這一膜融合的過程是由表達(dá)在細(xì)胞表面的病毒的包膜糖蛋白(或者稱為融合蛋白)所介導(dǎo)的。病毒的融合蛋白包含一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)區(qū)稱為融合肽(fusion peptide)，在融合過程中起著重要作用。一般認(rèn)為病毒介導(dǎo)的膜融合的過程包括下列階段：融合蛋白構(gòu)象的改變、融合肽的暴露、融合肽插入胞體膜、過渡的中間體的形成并最終伴隨著能量的轉(zhuǎn)移將兩個(gè)膜拉向一起，從而完成病毒膜與宿主細(xì)胞膜的融合過程。 病毒的融合蛋白所介導(dǎo)的膜融合是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞最重要的步驟，因此清楚的闡明這一過程將有助于新的藥物以及疫苗的產(chǎn)生，從而阻斷病毒的感染。在其它的包膜病毒中，利用分析病毒膜融合的過程已經(jīng)產(chǎn)生了針對(duì)病毒進(jìn)入的新的治療策略。例如，防治HIV感染的恩福韋得(enfuvirtide)就是在研究HIV gp41所介導(dǎo)的膜融合的基礎(chǔ)上研制出來的。此外，由于許多其它的包膜病毒利用同樣的機(jī)制進(jìn)入宿主細(xì)胞，因此我們可以利用相似的治療策略來防治許多的病毒性疾病。 作為包膜病毒的一種，漢坦病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，它的包膜也必須與宿主細(xì)胞膜融合，允許病毒的內(nèi)容物進(jìn)入宿主細(xì)胞。盡管漢坦病毒在酸性環(huán)境下可以引起細(xì)胞-細(xì)胞間融合的現(xiàn)象已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了二十多年，但是關(guān)于它的融合活性位點(diǎn)的確切定位以及導(dǎo)致這一過程的機(jī)制目前我們?nèi)匀恢跎�。已有的研究表明漢坦病毒的包膜糖蛋白可能參與了這一過程。此外，最近有國(guó)外學(xué)者用蛋白質(zhì)組學(xué)計(jì)算機(jī)分析的方法發(fā)現(xiàn)布尼亞病毒的G2糖蛋白與其它包膜病毒(甲病毒、黃病毒等)的融合蛋白在結(jié)構(gòu)上非常相似，而且有一段內(nèi)在的結(jié)構(gòu)區(qū)(在漢灘病毒位于氨基酸的第763-785位)在所有的布尼亞病毒的G2蛋白上都是保守的且有著相似的定位。因此推測(cè)G2蛋白可能是漢坦病毒的融合蛋白，而這段高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)則可能是它的融合肽。盡管有上述研究進(jìn)展，但是這些假說都缺乏足夠的證據(jù)支持。在本研究中我們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)漢坦病毒致細(xì)胞融合的機(jī)制進(jìn)行了初步探討，對(duì)上述假說提供了直接的證據(jù)。 具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分述如下： 第一部分：漢坦病毒具有融合活性的結(jié)構(gòu)蛋白基因片段的初步確定在本部分實(shí)驗(yàn)中我們利用真核表達(dá)載體分別將三株漢坦病毒(兩株漢灘病毒，一株漢城病毒)的核蛋白(NP)和糖蛋白(GPs)在Vero E6細(xì)胞中進(jìn)行了單獨(dú)表達(dá)以及共表達(dá)，然后進(jìn)行了細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明漢坦病毒M片段編碼的糖蛋白具有融合活性，能夠獨(dú)立的引起細(xì)胞融合。 材料和方法： 1．我們將三株病毒(兩株漢灘病毒，一株漢城病毒)的核衣殼蛋白和糖蛋白的基因S、M片段的編碼區(qū)分別插入到含CMV啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，構(gòu)建了六種表達(dá)漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組表達(dá)載體。 2．采用脂質(zhì)體法將每株病毒的糖蛋白和核蛋白的重組表達(dá)載體都進(jìn)行了單獨(dú)轉(zhuǎn)染以及共轉(zhuǎn)染Vero E6細(xì)胞。 3．采用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)以及免疫沉淀實(shí)驗(yàn)鑒定目的基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。 4．流式細(xì)胞儀分析結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞表面定位。 5．蛋白表達(dá)后進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)及其抑制實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1．間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)以及免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明三株漢坦病毒的包膜糖蛋白及核蛋白都能在Vero E6細(xì)胞中表達(dá)。 2．流式細(xì)胞儀分析表明只有糖蛋白能夠定位于細(xì)胞表面，而核蛋白則不能被轉(zhuǎn)運(yùn)于細(xì)胞表面。 3．在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞中可以觀察到細(xì)胞融合，而單獨(dú)表達(dá)核蛋白的細(xì)胞中則未出現(xiàn)融合現(xiàn)象，且將糖蛋白與核蛋白共表達(dá)并不能增強(qiáng)融合的強(qiáng)度。 4．在細(xì)胞融合抑制實(shí)驗(yàn)中，只有糖蛋白的單抗能阻斷細(xì)胞融合，而核蛋白的單抗則對(duì)融合活動(dòng)沒有明顯影響。 5．盡管融合強(qiáng)度有所差異，三株病毒都出現(xiàn)了相似的融合結(jié)果。 結(jié)論： 1．漢灘病毒M片段編碼的包膜糖蛋白可以獨(dú)立的介導(dǎo)細(xì)胞融合，這一過程不需要病毒的核衣殼蛋白以及RNA聚合酶的參與。 2．漢城病毒也表現(xiàn)出這一特征，因此這有可能是漢坦病毒屬共有的特征。 第二部分：N-連接的糖基化在漢灘病毒糖蛋白致細(xì)胞融合活動(dòng)中的作用在本部分實(shí)驗(yàn)中我們調(diào)查了漢灘病毒A9株包膜糖蛋白上的糖基化位點(diǎn)對(duì)融合活動(dòng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)G2上的N-連接的糖基化對(duì)于細(xì)胞融合是必不可少的�？紤]到該糖基化位點(diǎn)對(duì)維持G2蛋白的功能所起的重要作用我們認(rèn)為很可能G2就是漢灘病毒的融合蛋白。 材料和方法： 1．我們利用基因定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了八個(gè)基因突變的糖蛋白變異體，包括五個(gè)單突變和三個(gè)雙突變。為了構(gòu)建糖基化位點(diǎn)突變的糖蛋白突變體，我們將G1和G2上一個(gè)(單突變)或兩個(gè)(雙突變)糖基化位點(diǎn)上的天冬酰胺置換為丙氨酸。根據(jù)被替換的位置，突變體分別被命名為：N134A、N235A、N347A、N399A、N928A、N235／928A、N347／928A、N399／928A。 2．突變體同樣分別在Vero E6細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。然后采用免疫沉淀和流式細(xì)胞儀分析來檢測(cè)它們的表達(dá)和細(xì)胞表面定位。 3．蛋白表達(dá)后進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1．免疫沉淀的結(jié)果表明，糖蛋白變異體的分子量有明顯的漂移。在單突變的分子量大約減少了3000Da；雙突變則大約減少了6000 Da。這與此前的報(bào)道中丟失了一個(gè)或者兩個(gè)寡糖鏈的糖蛋白的分子量相符。這些結(jié)果表明點(diǎn)突變確實(shí)導(dǎo)致了糖基化位點(diǎn)的破壞。 2．流式細(xì)胞儀分析表明，除了突變體N134A僅表達(dá)了G2并且沒有能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面以外，其它的糖基化缺失的蛋白突變體都能夠在細(xì)胞表面表達(dá)。 3．在轉(zhuǎn)染突變體N134A的細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞融合活動(dòng)，其原因可能是沒有相關(guān)蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)。 4．其它糖基化缺失的突變體中，G1上糖基化的缺失對(duì)細(xì)胞融合沒有影響，而G2上的N-連接的糖基化(N928)的缺失則導(dǎo)致融合活動(dòng)的消失。 結(jié)論： G2上的N-連接的糖基化對(duì)于融合活動(dòng)是必須的，而G1上糖基化的缺失則對(duì)融合活動(dòng)沒有明顯影響�？紤]到N-連接的糖基化對(duì)于維持蛋白功能的重要作用，我們有理由認(rèn)為G2很可能是漢灘病毒的融合蛋白。 第三部分：漢灘病毒包膜糖蛋白上融合肽的初步確定 在本部分實(shí)驗(yàn)中我們調(diào)查了漢灘病毒A9株G2蛋白上一段高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)(氨基酸殘基763-785)在融合活動(dòng)中的作用。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)此保守區(qū)與膜融合密切相關(guān)，很可能是病毒的融合肽。 材料和方法： 1．我們選取G2上一段高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)(氨基酸殘基763-785)上具有結(jié)構(gòu)重要性的氨基酸進(jìn)行了基因定點(diǎn)突變，，使其置換為性質(zhì)相左的其他氨基酸。我們共構(gòu)建了十一個(gè)基因突變的糖蛋白變異體，根據(jù)糖蛋白突變體上氨基酸被替換的位置將突變體分別命名為：C765S、P767D、D769A、C770S、P771D、G772D、G774D、G776D、C777S、C780S、D785A。 2．突變體分別在Vero E6細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。然后采用免疫沉淀和流式細(xì)胞儀分析來檢測(cè)它們的表達(dá)和細(xì)胞表面定位。 3．蛋白表達(dá)后進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1．丙氨酸置換769位以及785位的天冬氨酸對(duì)細(xì)胞融合活動(dòng)以及蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)都沒有影響。 2．天冬氨酸置換767位和771位的脯氨酸以及絲氨酸置換780位的半胱氨酸導(dǎo)致G2糖蛋白的錯(cuò)誤折疊，從而不能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，因此未能觀察到細(xì)胞融合。 3．天冬氨酸置換772位、774位、776位的甘氨酸以及絲氨酸置換765位、770位、777位的半胱氨酸可以完全阻斷細(xì)胞融合的出現(xiàn)而不影響糖蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)。 結(jié)論： 此保守區(qū)多個(gè)特定的氨基酸的突變均可以完全阻斷細(xì)胞融合的出現(xiàn)而不影響糖蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)。這強(qiáng)烈提示此保守區(qū)與膜融合密切相關(guān)，很可能是病毒的融合肽。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 石曉宏，杭長(zhǎng)壽，宋干，梁米芳;漢灘病毒包膜糖蛋白G1和G2重組桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)及其免疫原性[J];病毒學(xué)報(bào);1995年03期

2 馬立憲;倪大石;董朝陽(yáng);王靈樞;;流行性出血熱患者尿液中融合細(xì)胞的檢測(cè)及其意義[J];病毒學(xué)雜志;1991年02期

3 馬立憲,邵麗華,趙麗,呂敏和,吳世英;腎綜合征出血熱病毒結(jié)構(gòu)蛋白在患者尿中融合細(xì)胞上的表達(dá)及其意義[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年02期

本文編號(hào)：2438250