【摘要】： 背景與目的： 黑色素瘤抗原(Melanoma antigen，MAGE)是從黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)性抗原(tumor-associated antigen，TAA)。MAGE是一類(lèi)超家族抗原，主要包括四個(gè)亞家族：MAGE-A，，MAGE-B，MAGE-C和MAGE-D，其中MAGE-A又包含MAGE-1至MAGE-12共12個(gè)基因。近年來(lái)，大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均報(bào)道MAGE-1基因在肝癌、食管癌、胃癌、舌癌、白血病、頭頸癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等常見(jiàn)腫瘤中都有較高的表達(dá)率，在正常組織中MAGE-1只表達(dá)于睪丸和胎盤(pán)，而睪丸和胎盤(pán)是免疫豁免組織，不會(huì)受到免疫活性細(xì)胞的攻擊。因此，MAGE-1在腫瘤中表達(dá)的廣泛性和相對(duì)特異性使其具有很好的應(yīng)用前景并以此成為研究的熱點(diǎn)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)8個(gè)由MAGE-1基因編碼的HLA-Ⅰ類(lèi)分子限制的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位，MAGE-1可以激活免疫系統(tǒng)中的前體T細(xì)胞形成特異性的CTL，CTL通過(guò)識(shí)別腫瘤表達(dá)的MAGE-1抗原特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞，這一結(jié)果為MAGE-1的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究表明，在腫瘤抗原的特異性識(shí)別過(guò)程中，B7作為T(mén)細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)，具有促進(jìn)T細(xì)胞增值，抑制T細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)抗原的敏感性，介導(dǎo)T、B細(xì)胞的黏附，促進(jìn)體液免疫應(yīng)答。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面不表達(dá)B7分子(B7-1或B7.2)或表達(dá)水平很低，致使第二信號(hào)通路受阻，無(wú)法誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生，將B7.2分子的cDNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞則能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。目前，有關(guān)B7.2在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用研究已有很多，Vasilevko等構(gòu)建MUC1粘蛋白(簡(jiǎn)稱(chēng)MUC1)和B7.2的共表達(dá)載體，以基因槍的方式免疫小鼠然后接種表達(dá)MUC1的乳腺癌細(xì)胞系，可以延長(zhǎng)成瘤時(shí)間，抑制腫瘤生長(zhǎng)。Disis的研究結(jié)果表明，編碼neu(編碼具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白)的和B7.2的質(zhì)粒經(jīng)皮下注射，可以誘發(fā)neu特異性的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。但將B7.2與MAGE-1基因融合構(gòu)建真核共表達(dá)質(zhì)粒，使得MAGE-1和B7.2能夠在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)，執(zhí)行協(xié)同抗腫瘤免疫效應(yīng)，還未見(jiàn)報(bào)道。本課題選用MAGE-1及B7.2基因片段，以pEGFP-C3質(zhì)粒為載體，構(gòu)建pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表達(dá)載體，并通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞株EC9706，觀(guān)察其表達(dá)，以獲得綠色熒光真核共表達(dá)載體pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1，旨在為進(jìn)一步探討以MAGE-1為靶點(diǎn)的腫瘤主動(dòng)免疫治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1．真核共表達(dá)載體pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的構(gòu)建：參照GenBank收入的B7.2及MAGE-1基因序列，應(yīng)用Oligo 6.0基因分析軟件分析設(shè)計(jì)PCR引物，并在每條引物前分別加上限制性酶切位點(diǎn)。用RNA提取試劑盒分別從乳腺組織、乳腺癌組織中提取總RNA。用RT-PCR方法，擴(kuò)增目的基因B7.2和MAGE-1片段。然后用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物B7.2基因片段和MAGE-1基因片段，并分別與載體pGEM-T Easy連接。將構(gòu)建的pGEM-T-B7.2用質(zhì)粒純化試劑盒提取，再用XhoⅠ、SalⅠ內(nèi)切酶將B7.2從質(zhì)粒上切取、膠回收純化后，與用XhoⅠ、SalⅠ酶切過(guò)的pEGFP-C3真核表達(dá)質(zhì)粒連接。分別將構(gòu)建的pGEM-T-MAGE-1、pEGFP-C3-B7.2質(zhì)粒用KpnⅠ、SalⅠ內(nèi)切酶消化，膠回收雙粘MAGE-1和雙粘pEGFP-C3-B7.2，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建的pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表達(dá)載體經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定。 2．人B7.2/MAGE-1轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞：應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，24h后在熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察融合基因的表達(dá)情況。G418加壓篩選20d，獲得穩(wěn)定表達(dá)融合基因的EC9706細(xì)胞，用RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)B7.2/MAGE-1基因的表達(dá)。 結(jié)果： 1．通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得B7.2目的基因片段(119-719)，加上兩端內(nèi)切酶位點(diǎn)為618個(gè)堿基對(duì)；通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得MAGE-1目的基因片段(626-1159)，加上兩端內(nèi)切酶位點(diǎn)約545個(gè)堿基對(duì)。 2．成功構(gòu)建了pGEM-T-B7.2及pGEM-T-MAGE-1原核重組載體，B7.2及MAGE-1基因的測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的一致。 3．成功構(gòu)建了pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核共表達(dá)載體，經(jīng)PCR和XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切鑒定其目的片段大小與預(yù)期的一致。 4．建立了穩(wěn)定表達(dá)B7.2/MAGE-1的EC9706細(xì)胞系，經(jīng)熒光顯微鏡觀(guān)察，轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光；用RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)B7.2/MAGE-1基因的表達(dá)，其大小與預(yù)期的一致。 結(jié)論 1．本研究成功構(gòu)建了MAGE-1與B7.2真核共表達(dá)載體。 2．本研究獲得了能穩(wěn)定表達(dá)MAGE-1和B7.2的EC9706細(xì)胞。 3．本研究為進(jìn)一步探討以MAGE-1為靶點(diǎn)的腫瘤主動(dòng)免疫治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2436272