【摘要】： 腎臟纖維化幾乎是所有慢性腎臟疾病發(fā)展到后期的病理學(xué)改變,其本質(zhì)是以細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚為特征的病理過程。Ⅰ型膠原在細(xì)胞外基質(zhì)聚集中起著不可或缺的作用,其中編碼為COL1A1的α1(I)起著主要的生物學(xué)作用。利用RNA干涉技術(shù)下調(diào)Ⅰ型膠原基因的過度表達(dá),以期成為延緩腎臟纖維化的新方法。 第一部分:人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA的設(shè)計(jì)篩選和鑒定 目的:針對(duì)I型膠原α1(I)鏈設(shè)計(jì)并篩選人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA(COL1A1-siRNA),并證實(shí)其有效性。方法:根據(jù)已知的設(shè)計(jì)原則,利用軟件設(shè)計(jì)人鼠完全同源的一對(duì)Ⅰ型膠原siRNA序列。將非特異性帶有熒光的siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞,顯微鏡下觀察大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。直接將I型膠原siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞,利用RT-PCR的方法觀察對(duì)大鼠系膜細(xì)胞I型膠原蛋白表達(dá)的抑制作用。結(jié)果:大鼠系膜細(xì)胞可以轉(zhuǎn)染非特異性siRNAI型膠原,從而可以作為siRNA實(shí)驗(yàn)研究的載體,轉(zhuǎn)染效率約為53.9%。將Ⅰ型膠原siRNA轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞,與空白對(duì)照組及MOCK組比較,各siRNA組均可見特異性513bp COL1A1基因條帶,并隨siRNA濃度增加,條帶逐漸減暗�？梢姠裥湍z原siRNA使Ⅰ型膠原表達(dá)下調(diào),并具劑量依賴性。結(jié)論:所設(shè)計(jì)的Ⅰ型膠原siRNA為人與大鼠完全同源的siRNA序列,所有堿基完全匹配。可以成功轉(zhuǎn)染到大鼠系膜細(xì)胞,并有效抑制I型膠原在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 第二部分人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 目的:建立Ⅰ型膠原siRNA表達(dá)質(zhì)粒,使其作用時(shí)間更長(zhǎng),表達(dá)更穩(wěn)定。方法:將所確定的Ⅰ型膠原siRNA作為靶點(diǎn),合成64 nt的寡核苷酸,經(jīng)過退火、T4多聚核苷酸激酶處理,與經(jīng)BamHⅠ和PstI酶切的線性化質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo定向連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞,并經(jīng)過PCR和測(cè)序鑒定。將構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠系膜細(xì)胞,RT-PCR觀察抑制作用。結(jié)果:與空白對(duì)照組、mock組電泳條帶比較,各siRNA質(zhì)粒組均可見特異性513bp COL1A1基因條帶,并隨siRNA質(zhì)粒濃度增加,條帶逐漸減暗�？梢姠裥湍z原siRNA質(zhì)粒同樣使Ⅰ型膠原表達(dá)下調(diào),效果顯著,并具劑量依賴性。結(jié)論:采用質(zhì)粒載體的方法同樣可以達(dá)到抑制Ⅰ型膠原形成的作用,而且表達(dá)更穩(wěn)定,作用更顯著。 第三部分人鼠同源Ⅰ型膠原siRNA對(duì)TGF-β_1誘導(dǎo)Ⅰ型膠原表達(dá)的抑制作用 目的:觀察病理情況下Ⅰ型膠原siRNA對(duì)人TGF-β_1誘導(dǎo)Ⅰ型膠原表達(dá)的抑制作用。方法:選用人TGF-β_1誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá),觀察表達(dá)效果。并利用Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒抑制其表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)TGF-β_1誘導(dǎo)的I型膠原基因的表達(dá)明顯增強(qiáng),并隨TGF-β_1劑量的增大,效果更顯著。經(jīng)刺激因子TGF-β_1誘導(dǎo)后,再轉(zhuǎn)染Ⅰ型膠原siRNA質(zhì)粒,可見與空白對(duì)照組、mock組比較,各刺激因子組條帶逐漸增強(qiáng),及單純予以刺激因子誘導(dǎo)的相對(duì)應(yīng)各組比較,轉(zhuǎn)染siRNA組條帶略減弱。結(jié)論:證實(shí)了所確定的siRNA載體在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,針對(duì)I型膠原的特異性siRNA在病理狀態(tài)下仍能有效抑制I型膠原基因增量調(diào)節(jié)后的過度表達(dá)水平,在強(qiáng)致病條件下仍能發(fā)揮其抑制作用。為今后的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),可通過進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中為減緩腎臟纖維化確立了較好的位點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R692;R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 周春華,梅長(zhǎng)林,高春芳,孟建中,雷霞,楊君;維拉帕米阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的α1(Ⅰ)膠原基因啟動(dòng)子的激活[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年08期

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5 卓文磊;王彥;張t，

本文編號(hào)：2435805