大鼠粘蛋白rMuc3酶切保守基序?qū)ζ涞鞍酌盖械挠绊懙难芯?/H1>
發(fā)布時間：2019-02-19 09:21
【摘要】： 目的:通過定點突變技術得到保守基序的各種突變體(p201/a、p20s_1/a、p20k/a、p20i/a、p20v_1/a、p20v_2/a),并通過Western blotting探討保守基序中各氨基酸對大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影響。 方法: 1、采用定點突變技術,設計相應突變引物,以p20為模板,基于PCR擴增得到突變體,并經(jīng)測序驗證。 2、用質(zhì)粒中量提取試劑盒得到足量的質(zhì)粒,然后利用陽離子脂質(zhì)體LipofectAMINE將各突變體及p20轉(zhuǎn)染入COS-7細胞中。 3、通過Western blotting檢測各突變體的表達,采用Quantity one分析各種突變體未酶切和酶切部分的表達強度,并分析未酶切部分所占比例。 結果: 1、使用PCR定點突變的方法,獲得突變體,經(jīng)序列測定后利用clustalx1.83軟件與模板p20比對,證實突變完全成功。并通過質(zhì)粒中量提取獲得了足量的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。 2、裂解細胞后將細胞裂解物進行Western blotting免疫印跡實驗,證實在55kDa處存在未酶切的部分,在30kDa處存在可被抗V5抗體檢測的N端部分,經(jīng)過Quantityone分析后發(fā)現(xiàn),S_2/A完全抑制了酶切的發(fā)生,G/A抑制了絕大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/A、I/A、V_1/A、V_2/A均對酶切產(chǎn)生了不同程度的抑制,未酶切部分分別為22%、39%、14%和17%,而K/A和S_1/A幾乎對酶切沒有影響,其未酶切部分分別為6%和3%,酶切效率與p20(未酶切部分占4%)幾乎一樣。 結論:以p20為模板的各種突變體突變成功,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所有突變體導入COS-7細胞并獲得了相應突變體的高效表達。通過Western blotting免疫印跡實驗結果揭示了酶切保守基序LS_1KGS_2IV_1V_2中各氨基酸對其蛋白酶切的發(fā)生是很重要的,其機理可能是因為此保守基序位于β2和β3片層之間的環(huán)狀區(qū),其上的氨基酸對于維持粘蛋白的構象是必須的。在S_1上可能有O型糖鏈的存在,并且去除此O型糖鏈不影響酶切保守基序LS_1KGS_2IV_1V_2的酶切。
[Abstract]:Objective: to obtain various mutants with conserved motifs by site-directed mutation technique. The effects of amino acids in conserved motifs on the digestion of rat mucin rMuc3 protease were studied by Western blotting. Methods: 1. Using site-directed mutagenesis technique, the corresponding mutated primers were designed, using p20 as template, the mutants were amplified based on PCR and confirmed by sequencing. 2. A large number of plasmids were obtained by plasmid extraction kit, and then the mutants and p20 were transfected into COS-7 cells by cationic liposome LipofectAMINE. (3) the expression of the mutants was detected by Western blotting, and the expression intensity of the undigested and digested parts of the mutants was analyzed by Quantity one, and the proportion of the undigested parts was analyzed. Results: 1. By using the method of PCR site-directed mutation, the mutants were obtained. After sequencing, clustalx1.83 software and template p20 were used to confirm that the mutation was completely successful. A sufficient number of plasmids were obtained by extraction of plasmids for transfection. (2) the cell lysate was detected by Western blotting assay. The results showed that there were no enzyme digested parts in 55kDa and N-terminal parts in 30kDa which could be detected by anti-V5 antibody. After Quantityone analysis, it was found that, S2 / A completely inhibited the occurrence of enzyme digestion. G / A inhibited most of the enzyme digestion (79% of the undigested part). The undigested part was 2240% and 17%, while K / A and S / A had almost no effect on the enzyme digestion. The undigested part was 6% and 3%, respectively, and the digesting efficiency was almost the same as that of p20 (4% of the undigested part). Conclusion: all the mutants using p20 as template were successfully transformed into COS-7 cells by liposome transfection and the corresponding mutants were highly expressed. The results of Western blotting showed that the amino acids in the conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2 were important for the proteolysis, and the mechanism might be that the conserved motifs were located in the annular region between 尾 _ 2 and 尾 _ 3 lamellae. The amino acids on it are necessary to maintain the conformation of mucin. There may be O-type sugar chain in S-1, and the removal of O-type sugar chain does not affect the enzyme digestion of conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363
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，
本文編號：2426364
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/binglixuelunwen/2426364.html
[Abstract]:Objective: to obtain various mutants with conserved motifs by site-directed mutation technique. The effects of amino acids in conserved motifs on the digestion of rat mucin rMuc3 protease were studied by Western blotting. Methods: 1. Using site-directed mutagenesis technique, the corresponding mutated primers were designed, using p20 as template, the mutants were amplified based on PCR and confirmed by sequencing. 2. A large number of plasmids were obtained by plasmid extraction kit, and then the mutants and p20 were transfected into COS-7 cells by cationic liposome LipofectAMINE. (3) the expression of the mutants was detected by Western blotting, and the expression intensity of the undigested and digested parts of the mutants was analyzed by Quantity one, and the proportion of the undigested parts was analyzed. Results: 1. By using the method of PCR site-directed mutation, the mutants were obtained. After sequencing, clustalx1.83 software and template p20 were used to confirm that the mutation was completely successful. A sufficient number of plasmids were obtained by extraction of plasmids for transfection. (2) the cell lysate was detected by Western blotting assay. The results showed that there were no enzyme digested parts in 55kDa and N-terminal parts in 30kDa which could be detected by anti-V5 antibody. After Quantityone analysis, it was found that, S2 / A completely inhibited the occurrence of enzyme digestion. G / A inhibited most of the enzyme digestion (79% of the undigested part). The undigested part was 2240% and 17%, while K / A and S / A had almost no effect on the enzyme digestion. The undigested part was 6% and 3%, respectively, and the digesting efficiency was almost the same as that of p20 (4% of the undigested part). Conclusion: all the mutants using p20 as template were successfully transformed into COS-7 cells by liposome transfection and the corresponding mutants were highly expressed. The results of Western blotting showed that the amino acids in the conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2 were important for the proteolysis, and the mechanism might be that the conserved motifs were located in the annular region between 尾 _ 2 and 尾 _ 3 lamellae. The amino acids on it are necessary to maintain the conformation of mucin. There may be O-type sugar chain in S-1, and the removal of O-type sugar chain does not affect the enzyme digestion of conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2.
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
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，本文編號：2426364
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