大鼠粘蛋白rMuc3酶切保守基序?qū)ζ涞鞍酌盖械挠绊懙难芯?/H1>
發(fā)布時(shí)間：2019-02-19 09:21
【摘要】： 目的:通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)得到保守基序的各種突變體(p201/a、p20s_1/a、p20k/a、p20i/a、p20v_1/a、p20v_2/a),并通過(guò)Western blotting探討保守基序中各氨基酸對(duì)大鼠粘蛋白rMuc3蛋白酶切的影響。 方法: 1、采用定點(diǎn)突變技術(shù),設(shè)計(jì)相應(yīng)突變引物,以p20為模板,基于PCR擴(kuò)增得到突變體,并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。 2、用質(zhì)粒中量提取試劑盒得到足量的質(zhì)粒,然后利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectAMINE將各突變體及p20轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞中。 3、通過(guò)Western blotting檢測(cè)各突變體的表達(dá),采用Quantity one分析各種突變體未酶切和酶切部分的表達(dá)強(qiáng)度,并分析未酶切部分所占比例。 結(jié)果: 1、使用PCR定點(diǎn)突變的方法,獲得突變體,經(jīng)序列測(cè)定后利用clustalx1.83軟件與模板p20比對(duì),證實(shí)突變完全成功。并通過(guò)質(zhì)粒中量提取獲得了足量的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。 2、裂解細(xì)胞后將細(xì)胞裂解物進(jìn)行Western blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn),證實(shí)在55kDa處存在未酶切的部分,在30kDa處存在可被抗V5抗體檢測(cè)的N端部分,經(jīng)過(guò)Quantityone分析后發(fā)現(xiàn),S_2/A完全抑制了酶切的發(fā)生,G/A抑制了絕大部分的酶切(未酶切部分占79%),L/A、I/A、V_1/A、V_2/A均對(duì)酶切產(chǎn)生了不同程度的抑制,未酶切部分分別為22%、39%、14%和17%,而K/A和S_1/A幾乎對(duì)酶切沒(méi)有影響,其未酶切部分分別為6%和3%,酶切效率與p20(未酶切部分占4%)幾乎一樣。 結(jié)論:以p20為模板的各種突變體突變成功,以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將所有突變體導(dǎo)入COS-7細(xì)胞并獲得了相應(yīng)突變體的高效表達(dá)。通過(guò)Western blotting免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了酶切保守基序LS_1KGS_2IV_1V_2中各氨基酸對(duì)其蛋白酶切的發(fā)生是很重要的,其機(jī)理可能是因?yàn)榇吮Ｊ鼗蛭挥讦?和β3片層之間的環(huán)狀區(qū),其上的氨基酸對(duì)于維持粘蛋白的構(gòu)象是必須的。在S_1上可能有O型糖鏈的存在,并且去除此O型糖鏈不影響酶切保守基序LS_1KGS_2IV_1V_2的酶切。
[Abstract]:Objective: to obtain various mutants with conserved motifs by site-directed mutation technique. The effects of amino acids in conserved motifs on the digestion of rat mucin rMuc3 protease were studied by Western blotting. Methods: 1. Using site-directed mutagenesis technique, the corresponding mutated primers were designed, using p20 as template, the mutants were amplified based on PCR and confirmed by sequencing. 2. A large number of plasmids were obtained by plasmid extraction kit, and then the mutants and p20 were transfected into COS-7 cells by cationic liposome LipofectAMINE. (3) the expression of the mutants was detected by Western blotting, and the expression intensity of the undigested and digested parts of the mutants was analyzed by Quantity one, and the proportion of the undigested parts was analyzed. Results: 1. By using the method of PCR site-directed mutation, the mutants were obtained. After sequencing, clustalx1.83 software and template p20 were used to confirm that the mutation was completely successful. A sufficient number of plasmids were obtained by extraction of plasmids for transfection. (2) the cell lysate was detected by Western blotting assay. The results showed that there were no enzyme digested parts in 55kDa and N-terminal parts in 30kDa which could be detected by anti-V5 antibody. After Quantityone analysis, it was found that, S2 / A completely inhibited the occurrence of enzyme digestion. G / A inhibited most of the enzyme digestion (79% of the undigested part). The undigested part was 2240% and 17%, while K / A and S / A had almost no effect on the enzyme digestion. The undigested part was 6% and 3%, respectively, and the digesting efficiency was almost the same as that of p20 (4% of the undigested part). Conclusion: all the mutants using p20 as template were successfully transformed into COS-7 cells by liposome transfection and the corresponding mutants were highly expressed. The results of Western blotting showed that the amino acids in the conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2 were important for the proteolysis, and the mechanism might be that the conserved motifs were located in the annular region between 尾 _ 2 and 尾 _ 3 lamellae. The amino acids on it are necessary to maintain the conformation of mucin. There may be O-type sugar chain in S-1, and the removal of O-type sugar chain does not affect the enzyme digestion of conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363
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本文編號(hào)：2426364
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/binglixuelunwen/2426364.html
[Abstract]:Objective: to obtain various mutants with conserved motifs by site-directed mutation technique. The effects of amino acids in conserved motifs on the digestion of rat mucin rMuc3 protease were studied by Western blotting. Methods: 1. Using site-directed mutagenesis technique, the corresponding mutated primers were designed, using p20 as template, the mutants were amplified based on PCR and confirmed by sequencing. 2. A large number of plasmids were obtained by plasmid extraction kit, and then the mutants and p20 were transfected into COS-7 cells by cationic liposome LipofectAMINE. (3) the expression of the mutants was detected by Western blotting, and the expression intensity of the undigested and digested parts of the mutants was analyzed by Quantity one, and the proportion of the undigested parts was analyzed. Results: 1. By using the method of PCR site-directed mutation, the mutants were obtained. After sequencing, clustalx1.83 software and template p20 were used to confirm that the mutation was completely successful. A sufficient number of plasmids were obtained by extraction of plasmids for transfection. (2) the cell lysate was detected by Western blotting assay. The results showed that there were no enzyme digested parts in 55kDa and N-terminal parts in 30kDa which could be detected by anti-V5 antibody. After Quantityone analysis, it was found that, S2 / A completely inhibited the occurrence of enzyme digestion. G / A inhibited most of the enzyme digestion (79% of the undigested part). The undigested part was 2240% and 17%, while K / A and S / A had almost no effect on the enzyme digestion. The undigested part was 6% and 3%, respectively, and the digesting efficiency was almost the same as that of p20 (4% of the undigested part). Conclusion: all the mutants using p20 as template were successfully transformed into COS-7 cells by liposome transfection and the corresponding mutants were highly expressed. The results of Western blotting showed that the amino acids in the conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2 were important for the proteolysis, and the mechanism might be that the conserved motifs were located in the annular region between 尾 _ 2 and 尾 _ 3 lamellae. The amino acids on it are necessary to maintain the conformation of mucin. There may be O-type sugar chain in S-1, and the removal of O-type sugar chain does not affect the enzyme digestion of conserved motif LS_1KGS_2IV_1V_2.
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
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10 李少麗;王昌慶;丁壯;叢彥龍;尹仁福;;拯救NA-1株鵝源新城疫病毒轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年
相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條
1 張中橋;胃癌免疫治療研究有新進(jìn)展[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年
2 紹興縣柯橋中學(xué) 陶志堅(jiān);限制性核酸內(nèi)切酶相關(guān)知識(shí)總結(jié)[N];學(xué)知報(bào);2011年
3 吉恩;以類鐸受體為靶標(biāo)的新藥研發(fā)前景廣闊[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年
4 衣曉峰 李華虹 喬蕤琳;先天性白內(nèi)障致病新位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)[N];健康報(bào);2006年
5 衣曉峰 聶松義 李華虹;哈醫(yī)大二院發(fā)現(xiàn)先天性白內(nèi)障新致病位點(diǎn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年
6 衣曉峰 本報(bào)記者 李華虹 喬蕤琳;專家研究發(fā)現(xiàn)先天性白內(nèi)障新致病位點(diǎn)[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年
7 馬艷紅;ApoEε4基因研究獲新發(fā)現(xiàn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年
8 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院鄭華;酶制劑在活性肽制備中的應(yīng)用[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2005年
9 本報(bào)記者 陳國(guó)東;詮釋生物制藥新概念[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年
10 王晶娟 張貴君 白根本;基因鑒定法檢測(cè)五種動(dòng)物藥[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2003年
相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條
1 彭志紅;大鼠粘蛋白rMuc3羧基端SEA組件酶切方式鑒定及功能探索[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年
2 郭金虎;人類新基因識(shí)別與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域鑒定[D];復(fù)旦大學(xué);2004年
3 王莉;CPP及ER滯留信號(hào)在腫瘤治療性肽疫苗中的修飾研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年
4 杜海寧;蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換和積聚的分子機(jī)制[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年
5 趙溫濤;蛋白質(zhì)拼接法制備片段同位素標(biāo)記ApoE及RAP結(jié)構(gòu)的初步研究[D];天津大學(xué);2007年
6 劉增然;利用淀粉的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建[D];四川大學(xué);2004年
7 郭強(qiáng);shRNA表達(dá)庫(kù)構(gòu)建方法研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年
8 朱小華;CpG基序甲基化狀態(tài)及其調(diào)控因素在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年
9 姚小磊;基于TGF-β1與Bcl-2的抗干眼癥中藥高通量篩選體系的建立[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2010年
10 姜延龍;新城疫病毒V4株全基因組測(cè)序及全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年
相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條
1 李宜成;大鼠粘蛋白rMuc3酶切保守基序?qū)ζ涞鞍酌盖械挠绊懙难芯縖D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年
2 王彪;兩個(gè)馬鈴薯Y病毒分離物的生物學(xué)和分子特性[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年
3 焦春波;ANN方法在蛋白酶體酶切研究中的應(yīng)用[D];大連理工大學(xué);2008年
4 蔣晶;人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒與散發(fā)型肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)性研究[D];吉林大學(xué);2009年
5 張巖;惡性瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞表面膜蛋白1 DBLα區(qū)的功能分析[D];吉林大學(xué);2009年
6 鄭文靜;馬鹿（Cervus elaphus）鹿茸角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）：基因克隆、序列分析及轉(zhuǎn)錄模式研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2006年
7 王信;青海蠶豆、豌豆病毒病調(diào)查和菜豆黃花葉病毒（BYMV）全系列分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年
8 陳佳;上西早生柿ETR5基因片段的克隆與植物表達(dá)載體的構(gòu)建[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年
9 吳喜林;靶向誘導(dǎo)GPG抗體及基序免疫概念論證[D];南京大學(xué);2012年
10 毛瓊國(guó);人基因組隨機(jī)MARs的分離、克隆及其功能的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年
，本文編號(hào)：2426364
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