【摘要】：目的:研究 RNA 干擾(RNAi)技術(shù)對 HepG2 細(xì)胞 AFP 基因表達(dá)的影響,以及抑制 AFP 表達(dá)后對 HepG2 細(xì)胞增殖及凋亡作用的影響。 方法:第一部分 RNA 干擾(RNA interference RNAi)抑制 HepG2 細(xì)胞 AFP 基因表達(dá)方法的建立。 1.目標(biāo)基因序列的選擇及質(zhì)粒載體構(gòu)建,經(jīng)Blast 軟件查對及序列同源性分析,選擇兩條目標(biāo)基因序列——AFP1 與AFP2,構(gòu)建質(zhì)粒載體 pGenesil-1-AFP1(含綠色熒光蛋白編碼序列)及pGenesil-2-AFP2。2.用陽離子脂質(zhì)體 META/質(zhì)粒載體 pGenesil-1-AFP1 不同劑量及濃度配比轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,并檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液 AFP 的量的變化,篩選出最佳陽離子脂質(zhì)體 META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1 配比。第二部分 RNA 干擾技術(shù)對 HepG2 細(xì)胞 AFP 基因表達(dá)的影響。1. 轉(zhuǎn)染試劑 METAFECTENE/質(zhì)粒載體混合液配制及轉(zhuǎn)染細(xì)胞。2.采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測轉(zhuǎn)染后 24,48,72 小時培養(yǎng)上清液中AFP的含量。3. 采用間接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察處理組和對照組細(xì)胞內(nèi)AFP基因表達(dá)情況,了解在細(xì)胞水平 pGenesil-AFP-siRNA 對 AFP 表達(dá)的抑制作用。第三部分 siRNA 抑制 AFP 表達(dá)對 HepG2 細(xì)胞增殖及凋亡的影響。分別應(yīng)用 MTT 比色法,DNA Fragmentation 及檢測細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平來觀察。 結(jié)果:1. 篩選出最佳的陽離子脂質(zhì)體META/質(zhì)粒載體pGenesil-1-AFP1轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配比為 8μl:2.5μg。 2. 轉(zhuǎn)染 pGenesil-1-siAFP1 與pGenesil-2-siAFP2 的實驗組與對照組比較,AFP 含量下降明顯(P0.01);pGenesil-1-siAFP1 實驗組與 pGenesil-2-siAFP2 實驗組比較,AFP 含量在各 時 段 均 顯 著 下 降 。 3. pGenesil-1-siAFP1 的 實 驗 組 干 擾 后 DNAFragmentation 觀察無細(xì)胞凋亡,但是 MTT 比色法發(fā)現(xiàn) siRNA-AFP1 的實驗組對細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,對細(xì)胞增殖抑制率最高達(dá) 51.35%。。而且實驗組細(xì)胞內(nèi)的 cAMP 濃度(15.64μmol/L)明顯低于各對照組細(xì)胞內(nèi)的cAMP 濃度(P0.01)。 結(jié)論: RNA 干擾技術(shù)能有效地抑制 HepG2 細(xì)胞 AFP 基因表達(dá),這種方法不僅對體外研究 AFP 基因功能有一定意義,而且為進(jìn)一步研究應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)抗腫瘤治療提供了依據(jù)。
[Abstract]:Aim: to study the effect of RNA interference (RNAi) on the expression of AFP gene in HepG2 cells and the effect of AFP inhibition on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells. Methods: the first part of RNA interference (RNA interference RNAi) inhibition of HepG2 cells AFP gene expression method. 1. Selection of target gene sequence and construction of plasmid vector. Two target gene sequences, AFP1 and AFP2, were selected by Blast software and sequence homology analysis. Construction of plasmid Vector pGenesil-1-AFP1 (containing Green fluorescent protein coding sequence) and pGenesil-2-AFP2.2. HepG2 cells were transfected with cationic liposome META/ plasmid pGenesil-1-AFP1 in different dosages and concentrations. The transfection efficiency was observed by fluorescence microscope, and the changes of the amount of AFP in the supernatant of cell culture were detected. The optimal ratio of cationic liposome META/ vector pGenesil-1-AFP1 was selected. The second part is the effect of RNA interference on the expression of AFP gene in HepG2 cells. 1. Transfection reagent METAFECTENE/ plasmid vector mixture prepared and transfected cells. 2. Microparticle chemiluminescence immunoassay was used to detect the content of AFP in the supernatant of culture supernatant for 72 hours after transfection. Indirect immunocytochemical technique was used to observe the expression of AFP gene in the cells of the treatment group and the control group, and to understand the inhibitory effect of pGenesil-AFP-siRNA on the expression of AFP at the cellular level. The third part is the effect of siRNA on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells by inhibiting the expression of AFP. MTT colorimetric method was used to detect, DNA Fragmentation and the intracellular cAMP level was measured. Results: 1. The optimal ratio of cationic liposome META/ plasmid vector pGenesil-1-AFP1 transfection complex was 8 渭 l: 2.5 渭 g. 2. Compared with the control group, the AFP content of the experimental group transfected with pGenesil-1-siAFP1 and pGenesil-2-siAFP2 decreased significantly (P0.01). The content of AFP in pGenesil-1-siAFP1 group was significantly lower than that in pGenesil-2-siAFP2 group. 3. No apoptosis was observed by DNAFragmentation in the experimental group of pGenesil-1-siAFP1, but MTT colorimetric assay showed that the experimental group of siRNA-AFP1 had obvious inhibitory effect on cell proliferation, and the highest inhibition rate was 51.35%. The intracellular cAMP concentration (15.64 渭 mol/L) in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P0.01). Conclusion: RNA interference technique can effectively inhibit the expression of AFP gene in HepG2 cells. This method not only has a certain significance for studying the function of AFP gene in vitro, but also provides a basis for further study on the application of RNA interference technique in antitumor therapy.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R363

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本文編號：2421117