【摘要】： 目的:RT-PCR擴(kuò)增出人源性成熟肽IL-24基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/ hIL-24,在大腸桿菌(E.coli)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化獲得重組融合蛋白rhIL-24。研究該重組蛋白在體外誘導(dǎo)THP-1人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞表達(dá)并產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用,為進(jìn)一步探索表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法:利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)hIL-24基因特異性引物,以提取正常成人的外周血單個(gè)核細(xì)胞的mRNA合成的cDNA為模板,RT- PCR擴(kuò)增目的基因片段,將其插入pQE30表達(dá)載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30/hIL-24,并通過酶切分析、PCR及測(cè)序鑒定。然后將其轉(zhuǎn)化至宿主菌M15中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物,鎳-瓊脂糖凝膠親和層析柱純化重組蛋白rhIL-24。用不同濃度的rhIL-24刺激人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1,通過ELISA法檢測(cè)到經(jīng)刺激后的THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6。再用Annexin V-FITC染色法檢測(cè)到經(jīng)rhIL-24處理后THP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。 結(jié)果:RT-PCR成功擴(kuò)增出hIL-24基因片段(474bp),構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE30/hIL-24,并在M15菌中高效表達(dá)出分子量約為19.2kDa的rhIL-24重組融合蛋白,超聲裂解后SDS-PAGE分析顯示目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以包涵體的形式表達(dá),經(jīng)鎳-瓊脂糖凝膠層析柱純化獲得純度在95%以上的rhIL-24。rhIL-24能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6,并以時(shí)間、劑量依賴方式刺激細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6,當(dāng)rhIL-24的濃度為28μg/mL時(shí)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量最多,分別為278.63±8.03pg/mL和49.48±6.92pg/mL;當(dāng)rhIL-24刺激THP-1細(xì)胞18h產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量則達(dá)到高峰。另外,rhIL-24以28μg/mL的濃度作用于THP-1細(xì)胞18h后發(fā)生的凋亡率最高。 結(jié)論: 1、成功克隆hIL-24基因并構(gòu)建了pQE30/hIL-24原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化E.coli后能高效表達(dá)出分子量約19.2kDa的重組融合蛋白。 2、rhIL-24能誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1表達(dá)并分泌炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6; 3、rhIL-24能誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1發(fā)生凋亡。
[Abstract]:Objective: to amplify the IL-24 gene of human sexual maturation peptide by RT-PCR, construct the recombinant plasmid pQE30/ hIL-24, and express it in Escherichia coli (E.coli), and purify the recombinant fusion protein rhIL-24.. To study the expression of THP-1 human monocytic leukemia cells and the levels of inflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-6, and the apoptosis of tumor cells induced by the recombinant protein in vitro. It provides experimental basis for further exploring the biological activity of the expressed protein. Methods: hIL-24 gene specific primers were designed by using primer design software. CDNA synthesized from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of normal adults was extracted as template. The target gene fragment was amplified by RT- PCR and inserted into pQE30 expression vector. The recombinant plasmid pQE30/hIL-24, was constructed and identified by enzyme digestion, PCR and sequencing. The recombinant protein rhIL-24. was purified by nickel agarose gel affinity chromatography. The expression product was analyzed and identified by SDS-PAGE and Western-Blot. THP-1, of human monocytic leukemia cells stimulated with different concentrations of rhIL-24 was used to detect TNF- 偽 and IL-6. produced by stimulated THP-1 cells by ELISA assay. Annexin V-FITC staining was used to detect the apoptosis of THP-1 cells treated with rhIL-24. Results: the hIL-24 gene fragment (474bp) was successfully amplified by RT-PCR, and the recombinant plasmid pQE30/hIL-24, was constructed. The recombinant rhIL-24 fusion protein with a molecular weight of about 19.2kDa was highly expressed in M15 strain. SDS-PAGE analysis after ultrasonic cleavage showed that the target protein was expressed in the form of inclusion body in the cell. Purified by nickel agarose gel chromatography, rhIL-24.rhIL-24 with purity of more than 95% could induce THP-1 cells to express TNF- 偽 and IL-6, for a period of time. When the concentration of rhIL-24 was 28 渭 g/mL, the quantity of TNF- 偽 and IL-6 was the highest, which was 278.63 鹵8.03pg/mL and 49.48 鹵6.92 PG / mL, respectively. When rhIL-24 stimulated THP-1 cells for 18 h, the production of TNF- 偽 and IL-6 reached its peak. In addition, the apoptosis rate of THP-1 cells treated with 28 渭 g/mL rhIL-24 for 18 h was the highest. Conclusion: 1. HIL-24 gene was cloned successfully and the prokaryotic expression vector of pQE30/hIL-24 was constructed. The recombinant fusion protein with molecular weight of about 19.2kDa could be expressed efficiently by transforming it into E.coli. 2rhIL-24 can induce the expression of THP-1 and the secretion of inflammatory cytokines TNF- 偽 and IL-6; 3rhIL-24 in human monocytic leukemia cells. RhIL-24 can induce THP-1 apoptosis in human monocytic leukemia cells.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2420508