【摘要】： 第一部分Snail真核表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增及轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究Snail基因在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中的轉(zhuǎn)染和表達(dá),Snail對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)性狀及生長等方面的影響,探討骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為Snail基因受體細(xì)胞的可行性。 方法:采用密度梯度離心法、貼壁篩選法并結(jié)合傳代對(duì)成人骨髓MSC進(jìn)行純化和體外擴(kuò)增,觀察細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物的表達(dá)特點(diǎn),流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓MSC表面抗原表達(dá),脂質(zhì)體法將重組真核表達(dá)載體(pCAGGSneo-snail-HA)及對(duì)照空質(zhì)粒(pCAGGSneo)轉(zhuǎn)染MSCs,G418篩選穩(wěn)定表達(dá),繪制轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長曲線,分別于轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和4周利用免疫熒光染色技術(shù)及免疫印跡法檢測(cè)MSCs報(bào)告基因HA及目的基因Snail表達(dá)情況。 結(jié)果:成人骨髓MSC培養(yǎng)3天后有散在呈針尖狀的貼壁細(xì)胞,7~10天后形成集落或融合呈纖維狀,3周左右細(xì)胞生長可匯合至80-90%,間充質(zhì)樣細(xì)胞呈長梭形,走向趨向一致,傳代后1周左右即可融合,3~5代后基本純化,細(xì)胞形態(tài)單一,細(xì)胞排列具有典型的旋渦狀結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:CD34表達(dá)陰性及CD29表達(dá)陽性;500μg/ml的G418是最適篩選濃度,pCAGGSneo-Snail-HA轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期的MSCs在蛋白水平均可檢測(cè)到目的基因snail及報(bào)告基因HA的表達(dá);生長曲線示重組真核表達(dá)載體(pCAGGSneo-snail-HA)及對(duì)照空質(zhì)粒(pCAGGSneo)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞(即MSCs-Sna和MSCs-neo)生長曲線與未轉(zhuǎn)染的同代MSCs相比,倍增時(shí)間稍稍延長,一代時(shí)間約比未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞多一天,而MSCs-Sna和MSCs-neo之間倍增時(shí)間及一代時(shí)間沒有明顯差異。 結(jié)論:分離培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞且成分單一,第3、5代細(xì)胞很純且生長旺盛,適用于做轉(zhuǎn)染或以后的研究,pCAGGSneo-snail-HA可以在MSCs內(nèi)獲得瞬時(shí)和長期表達(dá),且Snail表達(dá)對(duì)MSCs的生長速度無明顯影響。MSCs可以作為Snail基因的受體細(xì)胞,為下一步研究Snail對(duì)MSCs遷移趨化、存活抗凋亡及基質(zhì)金屬蛋白酶2分泌等生物學(xué)特性的影響奠定基礎(chǔ)。 第二部分Snail基因修飾誘導(dǎo)AKT、ERK活化對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響 目的:探討Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移力的影響,及磷脂酰肌醇3激酶( phosphatidylinosital3-kinase , PI-3K )、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)及P38絲裂原活化的蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase,P38 MAPK)等信號(hào)通路在Snail轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力改變中的調(diào)控作用。 方法:采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、Western Blot方法檢測(cè)Snail基因修飾后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)PI3K、ERK1/2和P38/MAPK信號(hào)通路的表達(dá)變化,用跨膜遷移實(shí)驗(yàn)(Transwell實(shí)驗(yàn))來評(píng)價(jià)MSCs的侵襲遷移能力,比較轉(zhuǎn)染Snail質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染對(duì)照空質(zhì)粒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的差異,并比較用和不用各信號(hào)通路干預(yù)劑的差異。 結(jié)果:Western blot結(jié)果表明, MSCs-Sna細(xì)胞P-ERK1/2與總ERK1/2的比值(ERK的磷酸化活性)顯著高于MSCs-neo組(0.14±0.04 vs. 0.6±0.09, P0.05)。同時(shí),MSCs-Sna細(xì)胞內(nèi)p-Akt與總Akt的比值(AKT的磷酸化活性)較MSCs-neo組亦顯著性增加(0.20±0.05 vs. 0.75±0.1, P0.05)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示P-ERK1/2、p-Akt在MSCs-neo中均為較弱的綠色熒光,且多分布在細(xì)胞胞漿內(nèi)。而在MSCs-Sna中P-ERK1/2、p-Akt熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),核內(nèi)亦存在較多分布。p-P38在MSCs-neo和MSCs-Sna細(xì)胞核和胞漿中均呈陰性表達(dá)。Transwell體外跨膜侵襲遷移實(shí)驗(yàn)顯示Snail質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs(MSCs-Sna)較對(duì)照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs(MSCs-neo)細(xì)胞遷移率增加(p0.05),PI-3K信號(hào)通路特異性抑制劑Wortmannin和ERK通路抑制劑PD98059能顯著抑制此遷移率的增加(p0.05)。各濃度P38通路抑制劑SB203580對(duì)MSCs-neo和MSCs-Sna的跨膜遷移數(shù)量均無明顯抑制作用(P0.05)。 結(jié)論: Snail基因修飾可增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞AKT、ERK1/2磷酸化水平,并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移,PI3K通路的特異性抑制劑Wortmannin和ERK通路抑制劑PD98059可分別抑制Snail修飾誘導(dǎo)的AKT、ERK1/2的磷酸化,降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力;SB203580對(duì)Snail的促細(xì)胞遷移作用無明顯影響。PI3K和ERK信號(hào)通路在Snail基因促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移功能的調(diào)控中可能發(fā)揮了重要作用。 第三部分Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CXCR4表達(dá)水平及向SDF-1趨化能力影響的研究 目的:觀察MSCs在Snail基因修飾后細(xì)胞膜表面相應(yīng)特異性受體CXCR4表達(dá)水平、及對(duì)SDF-1的趨化能力的變化。為探索提高M(jìn)SCs移植后向受損后局部常高表達(dá)SDF-1的器官組織趨化遷移能力的方法提供研究基礎(chǔ)。 方法:采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色、熒光標(biāo)記流式細(xì)胞儀技術(shù)及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Snail基因修飾后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上CXCR4受體的表達(dá)水平;采用體外Transwell跨膜趨化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)MSCs向SDF-1的趨向遷移能力,觀察大小不同濃度的抗CXCR4中和抗體對(duì)趨化實(shí)驗(yàn)的干預(yù)作用。 結(jié)果:流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)顯示,MSCs-neo和MSCs-Sna細(xì)胞表面均有CXCR4受體的表達(dá),其中MSCs-Sna的陽性表達(dá)率明顯高于MSCs-neo的陽性表達(dá)率(64.25%±7.22% vs. 7.45%±0.91%, P0.05)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示CXCR4在MSCs-neo和MSCs-Sna的細(xì)胞膜上均有陽性表達(dá),但在MSCs-neo中為較弱的綠色熒光,而在MSCs-Sna中CXCR4熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果顯示,以GAPDH mRNA為內(nèi)參照,在MSCs-neo、MSCs-Sna細(xì)胞中都有CXCR4 mRNA的表達(dá),但在MSCs-Sna細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于MSCs-neo(0.916±0.102 vs. 0.410±0.050,P0.05)。體外跨膜趨化遷移實(shí)驗(yàn)顯示,MSCs-Sna在SDF-1誘導(dǎo)下的細(xì)胞遷移量較MSCs-neo顯著增加(p0.05)。阻斷性CXCR4單抗(12G5)(中和抗體)加于微孔隔離室的上室后可顯著減少SDF-1α誘導(dǎo)的MSCs-Sna趨化運(yùn)動(dòng),且10ug/ml的CXCR4單抗對(duì)SDF-1α誘導(dǎo)的細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的抑制作用較強(qiáng)1ug/ml的CXCR4單抗作用更為明顯。同時(shí),IgG陰性對(duì)照抗體對(duì)SDF-1α誘導(dǎo)的MSCs-Sna趨化運(yùn)動(dòng)沒有抑制效應(yīng)。 結(jié)論:Snail可上調(diào)MSCs趨化因子受體CXCR4分子的表達(dá),并可通過這一環(huán)節(jié)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)相應(yīng)趨化因子SDF-1的趨化作用,這提示了通過上調(diào)Snail的表達(dá)而提高M(jìn)SCs向正調(diào)節(jié)表達(dá)SDF-1的受損組織(例如腦的缺血半暗帶等部位)遷移效率的可行性,為提高M(jìn)SCs的遷移能力及移植效率的研究方向提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為以后進(jìn)一步開展提高M(jìn)SCs向受損組織器官遷移的在體實(shí)驗(yàn)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第四部分Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用及對(duì)IL-4和無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究 目的:觀察Snail對(duì)骨髓MSCs在離體無血清培養(yǎng)下細(xì)胞骨架的變化及凋亡的影響,并研究Snail對(duì)MSCs在含IL-4培養(yǎng)基中發(fā)生凋亡的保護(hù)作用,為探索提高M(jìn)SCs移植后存活能力的方法提供研究基礎(chǔ)。 方法:MSCs-Sna及MSCs-neo于體外無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,β-Actin免疫熒光細(xì)胞染色觀察細(xì)胞骨架,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞Sub-G1凋亡峰,及Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率(Annexin V+/PI- %),并比較snail轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的MSCs(即MSC-sna及MSC-neo)在以上方面的差異。同樣的方法,MSCs-Sna及MSCs-neo在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后,收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果:無血清培養(yǎng)24小時(shí)后,MSCs-Sna細(xì)胞骨架排列保持正常有序分布狀態(tài),細(xì)胞長極存在較長的應(yīng)力纖維束,細(xì)胞輪廓清晰;而MSCs-neo細(xì)胞骨架排列出現(xiàn)紊亂,基本細(xì)胞形態(tài)尚保持。無血清培養(yǎng)72小時(shí)后可見,MSCs-neo不能維持正常形態(tài),輪廓模糊,萎縮成團(tuán)狀,細(xì)胞骨架斷裂紊亂;與之相比,MSCs-Sna無血清培養(yǎng)72小時(shí)后尚能維持基本形態(tài),細(xì)胞輪廓尚清晰,細(xì)胞骨架依然可見有序排列。無血清培養(yǎng)24小時(shí),MSCs-Sna和MSCs-neo之間比較凋亡率沒有顯著差異;無血清培養(yǎng)72小時(shí)后MSCs-Sna Sub-G1凋亡細(xì)胞率和Annexin V+/PI-%早期凋亡率(34.33%±5.51%和12.5%±2.2%)較MSCs-neo凋亡率(52%±8.19%和30%±4.3%)低,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);細(xì)胞在含IL-4(20ng/ml)和不含IL-4的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后,檢測(cè)annexin-V+PI- %(早期凋亡率),比較MSCs-Sna和MSCs-neo凋亡率的差異:加入IL-4后MSCs-neo的早期凋亡較未加入IL-4時(shí)增高達(dá)5倍,而對(duì)于轉(zhuǎn)染Snail表達(dá)載體后的MSCs(即MSCSs-Sna),加入IL-4后MSCs-Sna早期凋亡增高僅達(dá)未加入IL-4的2.6倍。 結(jié)論:經(jīng)Snail基因修飾,MSCs骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及在體外無血清培養(yǎng)或IL-4等促凋亡因素存在的環(huán)境中抗凋亡能力增加。 第五部分Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MMP2表達(dá)的影響及其信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究 目的研究Snail基因修飾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響,及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)和PI-3K/AKT信號(hào)通路在Snail轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MMP-2表達(dá)改變中的調(diào)控作用。 方法應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將攜帶Snail基因的重組載體pCAGGSneo-Snail-HA導(dǎo)入體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中,用G418篩選獲得陽性細(xì)胞。采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2 mRNA的表達(dá),明膠電泳酶譜分析細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的活力,并比較轉(zhuǎn)染Snail質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染對(duì)照空質(zhì)粒的MSCs的差異;阻斷實(shí)驗(yàn)以不同濃度ERK激酶特異性抑制劑(PD98059)或和PI3K通路特異性抑制劑(Wortmannin)干預(yù)后Western-blot檢測(cè)MSCs細(xì)胞ERK、AKT磷酸化水平變化,確定PD98059和Wortmannin分別抑制Snail誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞ERK激酶和AKT激酶磷酸化的有效濃度,進(jìn)而研究其對(duì)Snail轉(zhuǎn)染MSCsMMP-2 mRNA水平及培養(yǎng)上清中MMP-2活性的影響。 結(jié)果:(1)Western blot分析顯示MSCs-Sna細(xì)胞p-Akt和p-ERK水平較MSCs-neo均明顯增高;Wortmannin和PD98059可分別以劑量依賴性抑制MSCs-Sna細(xì)胞p-Akt和p-ERK水平;可有效抑制Snail誘導(dǎo)的MSCs細(xì)胞ERK激酶及AKT激酶磷酸化的PD98059和Wortmannin相應(yīng)濃度分別為50μmol/L和40 nmol/L。(2)以GAPDH mRNA為內(nèi)參照,RT-PCR結(jié)果顯示,MSCs-Sna細(xì)胞中MMP-2 mRNA的表達(dá)顯著高于MSCs-neo(0.680±0.104 vs. 1.803±0.301,P0.05);PD98059(50μmol/L)、Wortmannin(40 nmol/L)明顯抑制了Snail修飾誘導(dǎo)的MMP-2 mRNA水平,抑制率分別為33%和30%;而兩者聯(lián)合給予對(duì)MSCs-Sna細(xì)胞MMP-2基因表達(dá)的抑制作用具有協(xié)同作用,抑制率為56%,與MSCs-Sna組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.803±0.160 vs. 1.807±0.304, P0.05)。(3)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示MSCs-Sna有較高水平MMP-2活性,為對(duì)照組(MSCs-neo)的1.79±0.22倍(p0.05);而在50μmol/L PD98059作用后下降至(1.28±0.12)倍(P0.05);在40 nmol/L Wortmannin作用后下降至(1.24±0.21)倍(P0.05);PD98059與Wortmannin聯(lián)合干預(yù)后下降至(0.98±0.23)(P0.05);而SB203580處理對(duì)MSCs-Sna細(xì)胞MMP-2活力的影響無顯著性差異(P0.05)。 結(jié)論Snail能促進(jìn)MSCs的MMP-2的轉(zhuǎn)錄及MMP-2蛋白的表達(dá)。MMP-2可能是MSCs的細(xì)胞內(nèi)受轉(zhuǎn)錄因子Snail調(diào)控作用的耙基因之一,且ERK1/2及PI3K轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在此過程中具有調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2412850