【摘要】： 研究背景 神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損傷或功能異常所導(dǎo)致的痛覺異�；蛲从X過敏。創(chuàng)傷、缺血性損傷、感染或炎癥、腫瘤、藥物和壓迫等原因均可以引起神經(jīng)病理性疼痛。非甾體類抗炎藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥治療神經(jīng)病理性疼痛的效果差,臨床上常使用三環(huán)類抗抑郁藥和抗癲癇藥物進(jìn)行治療,但療效差,副作用大,能夠有效緩解50%以上疼痛癥狀的患者不足50%。因此尋找一種安全有效、作用持久的鎮(zhèn)痛方法已成為神經(jīng)病理性疼痛研究的重要方向。神經(jīng)病理性痛的受體機(jī)制研究表明,神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)表達(dá)上調(diào)或過度激活可引起中樞敏感化,在神經(jīng)病理性痛的產(chǎn)生如自發(fā)性痛,觸誘發(fā)痛及痛覺過敏等起重要作用。NMDA受體拮抗機(jī)如氯胺酮、MK-801等對(duì)神經(jīng)病理性痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用,但由于這些藥物具有如認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)空泡樣改變等副作用等限制了它們的臨床應(yīng)用。近期的研究表明,NMDA受體的亞型——NR2B型NMDA受體(NR2B)在體內(nèi)呈選擇性分布如主要分布于脊髓背角、前腦等與痛傳遞和痛情緒有關(guān)的區(qū)域,與痛感覺和痛情緒的形成密切相關(guān),這提示NR2B可能是一個(gè)潛在的鎮(zhèn)痛治療的靶點(diǎn)�，F(xiàn)在疫苗技術(shù)的發(fā)展不僅針對(duì)外源性抗原開發(fā)出各種疫苗,而且能對(duì)機(jī)體自身抗原制備特異性疫苗,如最近利用腫瘤細(xì)胞表面的特異性位點(diǎn)研制的疫苗已被證實(shí)能有效地預(yù)防和治療癌癥地發(fā)生發(fā)展。During等構(gòu)建的NMDAR1表位疫苗為防治中風(fēng)和癲癇后腦損傷提供了新的治療策略。據(jù)此,我們的假設(shè):以NR2B為抗原制備疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生NR2B抗體,該抗體與神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞膜上的NR2B結(jié)合,下調(diào)NR2B的表達(dá)或阻斷NR2B的激活,發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。因此,本研究旨在首先觀察NR2B多肽疫苗對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠的免疫效應(yīng)及鎮(zhèn)痛效應(yīng),然后構(gòu)建NR2B重組腺病毒(Recombinant adenovirus serotype 5 encoding NR2B gene, rAd5/NR2B)鎮(zhèn)痛疫苗,并通過口服免疫大鼠,以評(píng)價(jià)其對(duì)大鼠神經(jīng)病理性痛痛感覺和痛情緒的影響。 研究方法與結(jié)果 1、NR2B多肽疫苗對(duì)神經(jīng)病理性痛大鼠的免疫效應(yīng)及超前鎮(zhèn)痛效應(yīng) 方法:選取NR2B有免疫原性的一段氨基酸序列合成多肽,并與大分子蛋白載體匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白( Keyhole LimpetHemocyanin , KLH)交聯(lián)制備NR2B多肽疫苗即NR2B-KLH。健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為三組:PBS組、KLH組及NR2B組。分別用PBS+福氏佐劑, KLH+福氏佐劑和NR2B-KLH+福氏佐劑皮下注射三次,每次注射后兩周以間接ELISA法檢測(cè)受免大鼠血清NR2B特異性抗體的滴度,并以免疫組化染色法檢測(cè)大鼠免疫血清與脊髓背角NR2B蛋白的免疫結(jié)合反應(yīng)。于第三次免疫后一周結(jié)扎坐骨神經(jīng)的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支,保留腓腸神經(jīng)分支,建立SD大鼠保留神經(jīng)損傷性神經(jīng)病理性痛模型(Spared nerve injury, SNI)。術(shù)后隔日以u(píng)p-down法檢測(cè)大鼠術(shù)側(cè)后爪50%機(jī)械縮爪閾值的變化及熱痛縮爪時(shí)間的變化。分別于術(shù)前一天和術(shù)后7天經(jīng)枕骨大孔取腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)10～20μl,以間接ELISA法檢測(cè)CSF中NR2B抗體滴度。術(shù)后7天處死大鼠,取腰段脊髓(L4~6),以免疫組化染色法檢測(cè)脊髓背角c-Fos陽性神經(jīng)元數(shù)目,并采用Western blotting法檢測(cè)脊髓背角NR2B蛋白的改變。 結(jié)果:第二次注射后, NR2B組9只大鼠有6只大鼠出現(xiàn)NR2B抗體(0.5μg/ml)。第三次注射后9只大鼠均檢測(cè)到NR2B抗體(2.2μg/ml),且滴度較第一次明顯升高。在第三次注射后14天抗體滴度最高(7.2μg/ml),隨后抗體滴度逐漸降低,但初次注射后70天血清仍可檢測(cè)到NR2B抗體。而PBS組和KLH組未檢測(cè)到NR2B抗體。免疫組化染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NR2B大鼠血清可與大鼠脊髓背角結(jié)合呈陽性著色,而其余兩組未見著色。與術(shù)前比較,術(shù)后第7天PBS、KLH及NR2B各組50%縮爪閾值均明顯降低(P0.05);但各組間比較,NR2B組明顯高于其余兩對(duì)照組(P0.05)。各組術(shù)后7天熱痛縮爪時(shí)間與術(shù)前比較均有顯著升高(P0.05),但各組間比較,NR2B組明顯低于其余兩對(duì)照組(P0.05)。術(shù)后7天脊髓背角c-Fos蛋白陽性神經(jīng)元的數(shù)目NR2B組明顯低于兩對(duì)照組(P0.05)(NR2B組:170±22,PBS組:301±36,KLH組:280±25)。術(shù)前NR2B組大鼠腦脊液中NR2B抗體呈陰性,而術(shù)后7天呈陽性,而PBS組和KLH組這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均為陰性。Western blotting法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)術(shù)后7天NR2B組脊髓背角NR2B蛋白的表達(dá)較其余兩組明顯降低(P0.05)。 2、NR2B多肽疫苗對(duì)已發(fā)生的大鼠神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用 方法:選取雌性SD大鼠根據(jù)第一部分的方法制作SNI模型,術(shù)后每天檢測(cè)術(shù)側(cè)后爪50%機(jī)械縮爪閾值的改變。術(shù)后7天選取50%機(jī)械縮爪閾值與術(shù)前比較顯著降低的大鼠18只隨機(jī)分為三組:PBS組、KLH組及NR2B組,按照第一部分的免疫方法皮下免疫三次。第三次免疫后14天比較各組大鼠50%機(jī)械縮爪閾值、熱痛縮爪時(shí)間等改變;處死大鼠取血清,以間接ELISA方法檢測(cè)血清NR2B抗體滴度,取腰段脊髓以免疫組化方法分析脊髓背角GFAP蛋白的表達(dá)及星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀況。提取大鼠腰段脊髓總蛋白以western blotting檢測(cè)NR2B蛋白表達(dá)的改變。 結(jié)果:經(jīng)過三次免疫,在第三次免疫后14天NR2B組大鼠血清NR2B抗體的滴度為6.9±2.0μg/ml,而PBS組及KLH組未檢測(cè)到NR2B抗體。SNI術(shù)后第7天,PBS、KLH及NR2B各組大鼠50%縮爪閾值分別為2.5±1.4、2.4±0.9及2.0±0.6( g),而術(shù)前分別為13.0±1.9、11.7±2.2及12.6±2.7 (g),較術(shù)前明顯降低(P0.05),但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在第三次免疫后14天,NR2B組大鼠50%縮爪閾值為6.8±1.5 (g),而PBS組為3.2±1.3 (g),KLH組為3.7±1.4 (g),NR2B組明顯高于兩對(duì)照組(P0.05)。術(shù)后第7天, PBS、KLH、NR2B各組大鼠熱痛縮爪時(shí)間分別為9.4±1.9、7.8±2.4和8.2±1.9 ( S),而術(shù)前各組分別為2.4±1.0、3.4±1.2、2.2±0.9 (S),較術(shù)前明顯升高(P0.05),但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。在第三次免疫后14天,各組熱痛縮爪時(shí)間三組分別為7.9±1.6、7.3±1.9、4.6±1.2 (S),NR2B組明顯低于對(duì)照組(P0.05)。第三次免疫后14天NR2B組脊髓背角Ⅰ～Ⅱ星形膠質(zhì)細(xì)胞激活狀況明顯低于對(duì)照組(P0.05)。PBS、KLH及NR2B各組大鼠經(jīng)過三次免疫,脊髓背角NR2B蛋白與β-actin相對(duì)表達(dá)豐度分別為74±19 (%)、55±11 (%)、26±4 (%),NR2B組明顯低于對(duì)照組(P0.05)。 3、NR2B重組腺病毒鎮(zhèn)痛疫苗的構(gòu)建 方法:以限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-NR2B獲得目的基因NR2B;將NR2B定向克隆入腺病毒穿梭載體pDC515,并行酶切及DNA測(cè)序鑒定。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將pDC515-NR2B轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,并以RT-PCR及Western blotting方法分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)目的基因NR2B的表達(dá)。以攜帶NR2B基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒p515-NR2B和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞293,連續(xù)觀察細(xì)胞的變化(CPE及病毒空斑的出現(xiàn))。病毒空斑出現(xiàn)后,挑取病毒空斑再感染293細(xì)胞提取病毒DNA、RNA及蛋白,分別以PCR、RT-PCR及western blotting從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平對(duì)病毒空斑進(jìn)行鑒定和篩選;經(jīng)鑒定正確的病毒空斑進(jìn)行大量擴(kuò)增和純化并測(cè)定其滴度及純度,為體內(nèi)研究做準(zhǔn)備。 結(jié)果:質(zhì)粒pDC515-NR2B經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后得到4.9kb和3.9kb兩條DNA條帶,分別與目的片段NR2B和載體片段DC515大小一致,而且進(jìn)一步行測(cè)序鑒定,結(jié)果表明NR2B基因正確插入穿梭載體。提取被質(zhì)粒pDC515-NR2B轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見大小600bp的特異性DNA條帶,而未轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞未見此條帶;提取被轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的總蛋白經(jīng)Western blotting檢測(cè)可見分子量180kDa大小的蛋白條帶,而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞未見此蛋白條帶,這表明NR2B基因可在293細(xì)胞表達(dá)。以穿梭質(zhì)粒pDC515-NR2B和骨架質(zhì)粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,共轉(zhuǎn)染后12天可見293細(xì)胞變圓并逐漸從壁上脫落,細(xì)胞核占據(jù)細(xì)胞的大部分即所謂CPE改變;15天后較多出現(xiàn)CPE的細(xì)胞聚集在一起形成肉眼可見的病毒空斑。被感染的293細(xì)胞經(jīng)三次凍融、離心,提取NR2B重組腺病毒(recombinant adenovirus type 5 encoding NR2B, rAd5/NR2B)上清。分別以rAd5/NR2B原液、10倍、100倍,100倍稀釋液進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見大小600bp的DNA條帶,與陽性對(duì)照pDC515-NR2B的結(jié)果相同,而陰性對(duì)照(未用病毒感染的293細(xì)胞上清)未見到相應(yīng)DNA條帶。提取被rAd5/NR2B感染的293細(xì)胞的RNA行RT- PCR擴(kuò)增反應(yīng),可擴(kuò)增出600 bp大小的DNA條帶,而未感染病毒rAd5/NR2B的293細(xì)胞未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。提取被腺病毒感染的293細(xì)胞的蛋白并行Western blotting檢測(cè)分析,結(jié)果感染病毒rAd5/NR2B的293細(xì)胞有180kDa的蛋白條帶,而未感染該病毒的293細(xì)胞無此蛋白條帶。rAd5/NR2B經(jīng)大量擴(kuò)增及純化,病毒滴度為5×1011 (V.P./ml),經(jīng)HPLC法分析純度為100%。 4、NR2B重組腺病毒疫苗口服免疫對(duì)大鼠神經(jīng)病理性痛的超前鎮(zhèn)痛效應(yīng) 方法: rAd5/NR2B(1×108 PFU)口服免疫大鼠,2周后以相同劑量加強(qiáng)免疫一次,空白組和rAd5/EGFP組大鼠分別以PBS和rAd5/EGFP以同樣的劑量和同樣的方法免疫作為對(duì)照,每組16只。初次免疫后1周取4只大鼠處死,取大鼠近段小腸集合淋巴結(jié)組織,提取該組織RNA以RT-PCR方法檢測(cè)NR2B的表達(dá)。分別于免疫后2、4、6、8、10、15周截尾法取血0.5～1.0ml離心取血清檢測(cè)免疫血清NR2B抗體的滴度。免疫組化染色法檢測(cè)各組血清與大鼠脊髓背角NR2B蛋白的免疫結(jié)合反應(yīng)。加強(qiáng)免疫后2周,結(jié)扎大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分支,保留腓腸神經(jīng),建立SNI模型,術(shù)后隔日檢測(cè)大鼠術(shù)側(cè)后爪機(jī)械痛閾和熱痛縮爪時(shí)間的改變。術(shù)后一周取其中四只大鼠處死,取大鼠腰段脊髓(L4~6)),以免疫組化法檢測(cè)脊髓背角c-Fos表達(dá)的變化。分別于SNI術(shù)前一天和SNI術(shù)后1周和6周經(jīng)枕骨大孔取CSF 20～50μl,檢測(cè)CSF中NR2B抗體滴度。SNI術(shù)后6周取4只處死大鼠取腰段脊髓蛋白,檢測(cè)免疫大鼠脊髓背角NR2B蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果:大鼠經(jīng)疫苗rAd5/NR2B口服免疫1周后,提取近段小腸集合淋巴結(jié)組織RNA,經(jīng)RT-PCR反應(yīng)可見600bp大小的NR2B特異性DNA條帶,而空白組和rAd5/EGFP組無此條帶。 初次免疫后2周rAd5/NR2B組大鼠血清NR2B抗體平均滴度為5.5±1.9μg/ml;經(jīng)加強(qiáng)免疫后2周,NR2B抗體滴度進(jìn)一步升高為13.4±3.2μg/ml;在免疫后10周內(nèi)血清NR2B抗體滴度雖略有降低,但仍保持較高水平,免疫后15周血清仍可檢測(cè)到NR2B抗體存在。而在對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)空白組和rAd5/EGFP組大鼠血清未檢測(cè)到NR2B抗體存在。免疫組化染色發(fā)現(xiàn),rAd5/NR2B組血清可與脊髓背角NR2B蛋白發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng),呈陽性著色,而對(duì)照組未見陽性著色。 SNI術(shù)后1周受免大鼠脊髓背角c-Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)目rAd5/NR2B組顯著低于對(duì)照組(P0.05)。自SNI術(shù)后1周至SNI術(shù)后6周,rAd5/NR2B組50%機(jī)械縮爪閾值明顯高于對(duì)照組(P0.05),而熱痛縮爪時(shí)間明顯低于對(duì)照組(P0.05)。CSF中NR2B抗體在SNI術(shù)前一天各組均為陰性,SNI術(shù)后1周和6周天rAd5/NR2B組CSF中NR2B抗體轉(zhuǎn)為陽性,而對(duì)照組為陰性。Western blotting結(jié)果顯示,初次免疫后10周rAd5/NR2B組大鼠脊髓背角NR2B蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P0.05)。 5、NR2B重組腺病毒疫苗口服免疫對(duì)神經(jīng)病理性大鼠痛情緒反應(yīng)的影響 方法:通過位置偏愛實(shí)驗(yàn),選取24只無位置偏愛的SD大鼠,隨機(jī)分為三組:空白對(duì)照組、rAd5/EGF組以及rAd5/NR2B組,每組8只。rAd5/NR2B口服免疫,劑量1×108PFU,2周后以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次,此為rAd5/NR2B組。而對(duì)照組分別以PBS和rAd5/EGFP,按照同樣的劑量和方法免疫。加強(qiáng)免疫后2周,截尾法取血0.5～1.0ml并離心取血清,ELISA法檢測(cè)血清NR2B抗體的滴度。結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng),保留腓腸神經(jīng),制作SNI模型。SNI術(shù)后7天將大鼠放入位置回避箱內(nèi)進(jìn)行SNI條件性位置回避(SNI conditioned place avoidance,SNI-CPA)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)分為預(yù)處理期1天,訓(xùn)練期4天和測(cè)試期1天,三個(gè)階段,觀察并記錄大鼠在位置回避箱內(nèi)停留時(shí)間。分別于SNI術(shù)前一天和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)經(jīng)側(cè)腦室取CSF20μl左右,分別以ELISA法和western blotting檢測(cè)其中NR2B抗體滴度和CSF中NR2B抗體與前腦ACC神經(jīng)元膜蛋白的自身免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠取前腦ACC組織,分別以免疫組化方法和western blotting檢測(cè)前腦ACC組織NR2B蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果:加強(qiáng)免疫后2周,rAd5/NR2B組免疫血清NR2B抗體滴度為13.5±2.3μg/ml,而空白對(duì)照組和rAd5/EGFP組血清未檢測(cè)到NR2B抗體。SNI條件性位置回避時(shí)間(預(yù)處理期免疫大鼠在條件性位置回避箱停留時(shí)間與測(cè)試期停留時(shí)間的差值為條件性位置回避時(shí)間,此值越低提示痛情緒反應(yīng)越弱)空白組、rAd5/EGFP組以及rAd5/NR2B組分別為198±49,237±40和138±29 (S), rAd5/NR2B組與對(duì)照組比較明顯降低(P0.05)。CSF中NR2B抗體滴度檢測(cè)顯示, rAd5/NR2B組在SNI前為陰性,而SNI術(shù)后為抗體陽性,而對(duì)照組為陰性。western blotting結(jié)果表明rAd5/NR2B組CSF可與前腦ACC神經(jīng)元膜蛋白提取物呈特異性結(jié)合反應(yīng),而空白對(duì)照組和rAd5/EGFP組未見特異性結(jié)合反應(yīng)。ACC組織免疫組化及western blotting結(jié)果表明,rAd5/NR2B組大鼠前腦ACC神經(jīng)元NR2B蛋白的表達(dá)較空白對(duì)照組和rAd5/EGFP組明顯降低(P0.05)。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,組內(nèi)、組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以率表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論 NR2B多肽疫苗皮下三次免疫可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NR2B的體液性免疫性應(yīng)答,血清內(nèi)檢測(cè)到NR2B抗體。在神經(jīng)病理性痛時(shí),該抗體可進(jìn)入脊髓背角與NR2B蛋白結(jié)合,下調(diào)NR2B蛋白的表達(dá),對(duì)神經(jīng)病理性痛產(chǎn)生超前鎮(zhèn)痛作用。對(duì)已存在的神經(jīng)病理性痛,該疫苗皮下免疫也可減輕痛覺過敏。 將NR2B基因插入腺病毒載體,成功構(gòu)建NR2B重組腺病毒疫苗rAd5/NR2B。該疫苗口服免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的NR2B抗體,其滴度和持續(xù)時(shí)間優(yōu)于多肽疫苗。rAd5/NR2B疫苗口服免疫不但對(duì)神經(jīng)病理性痛痛感覺產(chǎn)生超前鎮(zhèn)痛作用,而且對(duì)神經(jīng)病理性痛伴隨的痛情緒反應(yīng)也有抑制作用。 研究總結(jié) 本研究首先采用NR2B多肽疫苗皮下免疫的方式證實(shí),NR2B疫苗不僅可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NR2B的體液性免疫應(yīng)答,而且在神經(jīng)病理性痛時(shí)NR2B抗體可進(jìn)入脊髓與脊髓背角NR2B結(jié)合,產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。針對(duì)亞單位疫苗的不足,本研究又將NR2B基因插入腺病毒載體構(gòu)建NR2B重組腺病毒疫苗rAd5/NR2B,而且分別從痛感覺和痛情緒兩方面觀察了該疫苗的鎮(zhèn)痛效應(yīng),為神經(jīng)病理性痛基因疫苗的治療提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R741;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2406600