【摘要】： 第一部分小鼠子宮標記滯留細胞的檢測 目的:研究小鼠子宮內(nèi)標記滯留細胞的存在及其分布特點。 方法:選擇出生三天的雌性昆明白小乳鼠,實驗組乳鼠皮下注射BrdU50ug/g,對照組皮下注射生理鹽水100ul,每天2次,共注射3d。于最后一次注射后2h、1w、2w、4w和8w處死并取子宮固定,石蠟包埋用于免疫組化檢測,每個時間段5只乳鼠。 結(jié)果:實驗組標記后2h,小鼠腺體和基質(zhì)中標記滯留細胞(LRCs)表達最高,分別為45.1%和57.4%,隨著時間的增加,LRCs逐漸降低,到第8w在腺體中僅有極少量細胞表達,而基質(zhì)細胞約有1.5%的LRCs,主要位于血管周圍和內(nèi)膜基層連接處。不同時相腺體和基質(zhì)細胞中LRCs差異具有顯著性(P0.05)。 結(jié)論:昆明白小鼠子宮內(nèi)LRCs主要位于血管周圍和內(nèi)膜基層連接處等,這些LRCs可能為子宮內(nèi)膜干細胞。 第二部分體外培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜形成克隆能力的檢測 目的:通過體外培養(yǎng)檢測小鼠子宮內(nèi)膜細胞克隆能力。 方法:取出生3d的昆明白雌性小鼠,將其子宮剪碎后用0.125%胰酶消化,計數(shù)活細胞,按300個/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)12d左右。觀察細胞及克隆生長特點,并測量細胞克隆大小和計算克隆形成率。同時取成年小鼠子宮培養(yǎng)作為對照。通過組織來源、細胞生長形態(tài)、細胞增殖能力以及角蛋白和波型蛋白免疫組化等進行鑒定,并用免疫熒光法檢測腺體克隆Ki-67增殖指數(shù)。 結(jié)果:根據(jù)細胞組織來源分有腺體和基質(zhì)兩種克隆,根據(jù)細胞克隆大小和生長特點,分大克隆和小克隆兩種類型。腺體大克隆和小克隆的大小分別為3.64±1.1和0.53±0.24mm,克隆形成率分別為0.051±0.013%和0.11±0.07%;基質(zhì)大克隆和小克隆的直徑大小分別為2.82±0.5和0.41±0.13mm,克隆形成率分別為0.008±0.001%和0.43±0.03%。四種克隆的克隆形成率均具有顯著性差異(P0.05),腺體和基質(zhì)大克隆直徑大小,腺體和基質(zhì)小克隆直徑大小分別兩兩比較,差異不均具有顯著性(P0.05),而腺體大小克隆大小比較,基質(zhì)大小克隆分別兩兩比較,差異具有均顯著性(P0.05)。成年小鼠子宮有限稀釋法原代培養(yǎng)無細胞克隆生長。腺體大克隆Ki-67增殖指數(shù)高于腺體小克隆(P0.05)。 結(jié)論:子宮內(nèi)膜細胞在體外培養(yǎng)中,可以形成單細胞克隆,腺體和基質(zhì)細胞均可形成大克隆和小克隆。腺體大克隆增殖能力高于小克隆。 第三部分EGF和17β-雌二醇對細胞克隆生長的影響 目的:研究EGF和17β-雌二醇對子宮內(nèi)膜細胞克隆生長的影響。 方法:在培養(yǎng)基中分別加入10ng/ml的EGF和5×10-8 mol/L的17β-雌二醇,按照第二部分方法對小鼠子宮進行原代培養(yǎng),觀察細胞形態(tài),測量克隆大小并計算細胞克隆形成率,同時用無特殊添加成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照。 結(jié)果:與對照組比較,EGF組四種克隆形成率且克隆直徑均值略高,但是差異不具有顯著性(均P0.05)。17β-雌二醇組兩種小克隆克隆形成率均值略高,而兩種大克隆克隆形成率較低,與對照組分別比較差異不具有顯著性(均P0.05)。17β-雌二醇組腺體大克隆大于對照組,差異具有顯著性(P0.05), 17β-雌二醇組與EGF組比較,細胞克隆形成率和大小差異均不具有顯著性(P0.05)。 結(jié)論:添加EGF和17β-雌二醇對小鼠子宮在體外培養(yǎng)時,并不能增加其克隆形成率,雌激素在體外有促進腺體克隆細胞分化的作用。 第四部分小鼠間充質(zhì)干細胞向子宮內(nèi)膜方向分化的實驗研究 目的:探索小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向子宮內(nèi)膜的遷移和分化 方法: 1.體外原代培養(yǎng)雄性小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,并在體外用BrdU體外標記,用CD34和CD29抗體進行免疫組化鑒定,用BrdU抗體檢測其標記陽性率。 2.骨髓移植模型:雌性小鼠放療后,從鼠尾靜脈注射移植間充質(zhì)干細胞,作為放療后移植組;同時設放療對照和正常對照組。每組8只小鼠。 3.觀察小鼠的一般情況,在小鼠瀕死前或者生存60d后,處死小鼠,取其子宮一側(cè)固定石蠟包埋,用于BrdU免疫組化;另一側(cè)子宮提取DNA,用于PCR檢測Sry基因表達。 結(jié)果: 1.間充質(zhì)干細胞呈梭形或多角形,經(jīng)免疫組化鑒定CD29(+)和CD34(-),符合間充質(zhì)干細胞特性。Brdu標記陽性率約為80%。 2.骨髓移植模型:放療對照組在放療后14d小鼠死亡7/8只;移植組移植后4只存活時間20d,2只存活時間30d,2只存活時間60d。放療對照組、正常對照組和移植組早期死亡小鼠子宮Brdu檢測為陰性。移植組短期存活和長期存活的小鼠,Brdu陽性主要表達在子宮腺體和基質(zhì)之間的毛細血管內(nèi)皮細胞及少量基質(zhì)細胞核內(nèi)。正常對照組和放療組小鼠子宮SRY基因檢測為陰性。移植組早期死亡、短期存活和長期存活的小鼠子宮SRY基因表達均為陽性。 結(jié)論:小鼠間充質(zhì)干細胞可以遷移到子宮,并有可能成為子宮內(nèi)膜修復的細胞來源。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【引證文獻】

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1 田甜;粒細胞集落刺激因子對大鼠薄型子宮內(nèi)膜治療的初步研究[D];中南大學;2012年

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本文編號：2405104