【摘要】： 第一部分小鼠子宮標(biāo)記滯留細(xì)胞的檢測(cè) 目的:研究小鼠子宮內(nèi)標(biāo)記滯留細(xì)胞的存在及其分布特點(diǎn)。 方法:選擇出生三天的雌性昆明白小乳鼠,實(shí)驗(yàn)組乳鼠皮下注射BrdU50ug/g,對(duì)照組皮下注射生理鹽水100ul,每天2次,共注射3d。于最后一次注射后2h、1w、2w、4w和8w處死并取子宮固定,石蠟包埋用于免疫組化檢測(cè),每個(gè)時(shí)間段5只乳鼠。 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記后2h,小鼠腺體和基質(zhì)中標(biāo)記滯留細(xì)胞(LRCs)表達(dá)最高,分別為45.1%和57.4%,隨著時(shí)間的增加,LRCs逐漸降低,到第8w在腺體中僅有極少量細(xì)胞表達(dá),而基質(zhì)細(xì)胞約有1.5%的LRCs,主要位于血管周?chē)蛢?nèi)膜基層連接處。不同時(shí)相腺體和基質(zhì)細(xì)胞中LRCs差異具有顯著性(P0.05)。 結(jié)論:昆明白小鼠子宮內(nèi)LRCs主要位于血管周?chē)蛢?nèi)膜基層連接處等,這些LRCs可能為子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。 第二部分體外培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜形成克隆能力的檢測(cè) 目的:通過(guò)體外培養(yǎng)檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞克隆能力。 方法:取出生3d的昆明白雌性小鼠,將其子宮剪碎后用0.125%胰酶消化,計(jì)數(shù)活細(xì)胞,按300個(gè)/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)12d左右。觀察細(xì)胞及克隆生長(zhǎng)特點(diǎn),并測(cè)量細(xì)胞克隆大小和計(jì)算克隆形成率。同時(shí)取成年小鼠子宮培養(yǎng)作為對(duì)照。通過(guò)組織來(lái)源、細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞增殖能力以及角蛋白和波型蛋白免疫組化等進(jìn)行鑒定,并用免疫熒光法檢測(cè)腺體克隆Ki-67增殖指數(shù)。 結(jié)果:根據(jù)細(xì)胞組織來(lái)源分有腺體和基質(zhì)兩種克隆,根據(jù)細(xì)胞克隆大小和生長(zhǎng)特點(diǎn),分大克隆和小克隆兩種類(lèi)型。腺體大克隆和小克隆的大小分別為3.64±1.1和0.53±0.24mm,克隆形成率分別為0.051±0.013%和0.11±0.07%;基質(zhì)大克隆和小克隆的直徑大小分別為2.82±0.5和0.41±0.13mm,克隆形成率分別為0.008±0.001%和0.43±0.03%。四種克隆的克隆形成率均具有顯著性差異(P0.05),腺體和基質(zhì)大克隆直徑大小,腺體和基質(zhì)小克隆直徑大小分別兩兩比較,差異不均具有顯著性(P0.05),而腺體大小克隆大小比較,基質(zhì)大小克隆分別兩兩比較,差異具有均顯著性(P0.05)。成年小鼠子宮有限稀釋法原代培養(yǎng)無(wú)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。腺體大克隆Ki-67增殖指數(shù)高于腺體小克隆(P0.05)。 結(jié)論:子宮內(nèi)膜細(xì)胞在體外培養(yǎng)中,可以形成單細(xì)胞克隆,腺體和基質(zhì)細(xì)胞均可形成大克隆和小克隆。腺體大克隆增殖能力高于小克隆。 第三部分EGF和17β-雌二醇對(duì)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的影響 目的:研究EGF和17β-雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的影響。 方法:在培養(yǎng)基中分別加入10ng/ml的EGF和5×10-8 mol/L的17β-雌二醇,按照第二部分方法對(duì)小鼠子宮進(jìn)行原代培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài),測(cè)量克隆大小并計(jì)算細(xì)胞克隆形成率,同時(shí)用無(wú)特殊添加成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對(duì)照。 結(jié)果:與對(duì)照組比較,EGF組四種克隆形成率且克隆直徑均值略高,但是差異不具有顯著性(均P0.05)。17β-雌二醇組兩種小克隆克隆形成率均值略高,而兩種大克隆克隆形成率較低,與對(duì)照組分別比較差異不具有顯著性(均P0.05)。17β-雌二醇組腺體大克隆大于對(duì)照組,差異具有顯著性(P0.05), 17β-雌二醇組與EGF組比較,細(xì)胞克隆形成率和大小差異均不具有顯著性(P0.05)。 結(jié)論:添加EGF和17β-雌二醇對(duì)小鼠子宮在體外培養(yǎng)時(shí),并不能增加其克隆形成率,雌激素在體外有促進(jìn)腺體克隆細(xì)胞分化的作用。 第四部分小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜方向分化的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探索小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜的遷移和分化 方法: 1.體外原代培養(yǎng)雄性小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并在體外用BrdU體外標(biāo)記,用CD34和CD29抗體進(jìn)行免疫組化鑒定,用BrdU抗體檢測(cè)其標(biāo)記陽(yáng)性率。 2.骨髓移植模型:雌性小鼠放療后,從鼠尾靜脈注射移植間充質(zhì)干細(xì)胞,作為放療后移植組;同時(shí)設(shè)放療對(duì)照和正常對(duì)照組。每組8只小鼠。 3.觀察小鼠的一般情況,在小鼠瀕死前或者生存60d后,處死小鼠,取其子宮一側(cè)固定石蠟包埋,用于BrdU免疫組化;另一側(cè)子宮提取DNA,用于PCR檢測(cè)Sry基因表達(dá)。 結(jié)果: 1.間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形或多角形,經(jīng)免疫組化鑒定CD29(+)和CD34(-),符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性。Brdu標(biāo)記陽(yáng)性率約為80%。 2.骨髓移植模型:放療對(duì)照組在放療后14d小鼠死亡7/8只;移植組移植后4只存活時(shí)間20d,2只存活時(shí)間30d,2只存活時(shí)間60d。放療對(duì)照組、正常對(duì)照組和移植組早期死亡小鼠子宮Brdu檢測(cè)為陰性。移植組短期存活和長(zhǎng)期存活的小鼠,Brdu陽(yáng)性主要表達(dá)在子宮腺體和基質(zhì)之間的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及少量基質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)。正常對(duì)照組和放療組小鼠子宮SRY基因檢測(cè)為陰性。移植組早期死亡、短期存活和長(zhǎng)期存活的小鼠子宮SRY基因表達(dá)均為陽(yáng)性。 結(jié)論:小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞可以遷移到子宮,并有可能成為子宮內(nèi)膜修復(fù)的細(xì)胞來(lái)源。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R329

【引證文獻(xiàn)】

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1 田甜;粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)大鼠薄型子宮內(nèi)膜治療的初步研究[D];中南大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：2405104