【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模撼醪窖芯啃∈笤葱钥笴D52單克隆抗體HI186的生物學(xué)功能。利用現(xiàn)有小鼠雜交瘤制備HI186單鏈抗體(ScFv)，結(jié)合其生物學(xué)功能的研究，為日后應(yīng)用于臨床治療打下基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法：1．應(yīng)用胎盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞、MTT法檢測(cè)活細(xì)胞和Annexin V染色特異性檢測(cè)凋亡細(xì)胞等方法研究不同克隆株的抗CD52單克隆抗體對(duì)部分白血病細(xì)胞系的作用，比較其生物學(xué)功能和作用的異同。2．RT-PCR的方法克隆小鼠雜交瘤HI186的抗體基因輕、重鏈可變區(qū)基因，，利用overlap-PCR方法構(gòu)建HI186-ScFv融合基因，定向克隆入原核表達(dá)載體pET22b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b／HI186-ScFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BL2 1感受態(tài)菌株。在IPTG存在條件下，誘導(dǎo)表達(dá)HI186單鏈抗體。所得融合蛋白經(jīng)復(fù)性、純化后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其與天然細(xì)胞膜CD52蛋白的結(jié)合活性和特異性；Western blot印證其與變性線形蛋白結(jié)合活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．HI186單克隆抗體對(duì)于CEM、LCL-H、HPB-ALL、REH等CD52陽(yáng)性白血病細(xì)胞系在體外具有一定的生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用。 2．?dāng)U增HI186重鏈可變區(qū)基因342bp，m186輕鏈可變區(qū)基因339bp。 3．overlap-PCR構(gòu)建包含linker的HI186ScFv單鏈抗體融合基因，全長(zhǎng)為759bp，經(jīng)酶切轉(zhuǎn)入pET22b質(zhì)粒，構(gòu)建pET22b／HI186-ScFv，在IPTG存在下可誘導(dǎo)高表達(dá)HI186-ScFv單鏈抗體融合蛋白。 4．抗體免疫競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明HI186-ScFv單鏈抗體與原鼠源性HI186單克隆抗體具有相同的結(jié)合表位，可以抑制HI186單克隆抗體與細(xì)胞膜表面CD52天然抗原的結(jié)合，同時(shí)也可以結(jié)合變性的具有良好的結(jié)合活性和特異性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：HI186單克隆抗體生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明對(duì)相應(yīng)的白血病細(xì)胞系具有抑制生長(zhǎng)作用，并且具有誘導(dǎo)凋亡作用。在成功構(gòu)建了HI186-ScFv單鏈抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)一步研究其應(yīng)用的可能性，并據(jù)此對(duì)其進(jìn)行繼續(xù)改造。
[Abstract]:Objective: to study the biological function of murine anti-CD52 monoclonal antibody HI186. The preparation of HI186 single chain antibody (ScFv),) from mouse hybridoma combined with its biological function will lay a foundation for clinical treatment in the future. Methods: 1. To study the effect of monoclonal antibody against CD52 on some leukemia cell lines by using the method of fetal trypan blue staining to count living cells, MTT assay to detect living cells and Annexin V staining to detect specific apoptotic cells, etc. 2.RT-PCR method was used to clone mouse hybridoma HI186 antibody gene with light and heavy chain variable region gene. HI186-ScFv fusion gene was constructed by overlap-PCR method and cloned into prokaryotic expression vector pET22b,. Construction of Recombinant plasmid pET22b/HI186-ScFv. The recombinant plasmid was transfected into BL2 1 competent strain. In the presence of IPTG, the expression of HI186 scFv was induced. The fusion protein was renatured and purified. The binding activity of the fusion protein to the CD52 protein of natural cell membrane and the specific; Western blot activity were determined by flow cytometry to confirm the binding activity of the fusion protein to denatured linear protein. The results showed that 1.HI186 monoclonal antibody could inhibit the growth and promote apoptosis of CD52 positive leukemia cell lines such as CEM,LCL-H,HPB-ALL,REH in vitro. 2.Amplification of HI186 heavy chain variable region gene 342bpnm186 light chain variable region gene 339bp. HI186ScFv single chain antibody fusion gene containing linker was constructed by 3.overlap-PCR. The full length of the fusion gene was 759 BP. The fusion gene was digested into pET22b plasmid. PET22b/HI186-ScFv, could induce high expression of HI186-ScFv single chain antibody fusion protein in the presence of IPTG. 4. The immuno-competitive assay showed that HI186-ScFv single-chain antibody had the same binding epitope with proto-murine HI186 monoclonal antibody, and could inhibit the binding of HI186 monoclonal antibody to the natural CD52 antigen on the surface of cell membrane. At the same time, it can also bind to denaturation with good binding activity and specificity. Conclusion: HI186 monoclonal antibody can inhibit the growth and induce apoptosis of leukemia cell line. Based on the successful construction of HI186-ScFv scFv, the possibility of its application should be further studied and modified accordingly.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2401701