發(fā)布時間：2019-01-05 11:10

【摘要】： 實驗目的：初步研究小鼠源性抗CD52單克隆抗體HI186的生物學功能。利用現(xiàn)有小鼠雜交瘤制備HI186單鏈抗體(ScFv)，結合其生物學功能的研究，為日后應用于臨床治療打下基礎。 實驗方法：1．應用胎盼藍染色計數(shù)活細胞、MTT法檢測活細胞和Annexin V染色特異性檢測凋亡細胞等方法研究不同克隆株的抗CD52單克隆抗體對部分白血病細胞系的作用，比較其生物學功能和作用的異同。2．RT-PCR的方法克隆小鼠雜交瘤HI186的抗體基因輕、重鏈可變區(qū)基因，，利用overlap-PCR方法構建HI186-ScFv融合基因，定向克隆入原核表達載體pET22b，構建重組質粒pET22b／HI186-ScFv。將重組質粒轉染入BL2 1感受態(tài)菌株。在IPTG存在條件下，誘導表達HI186單鏈抗體。所得融合蛋白經復性、純化后，通過流式細胞術檢測其與天然細胞膜CD52蛋白的結合活性和特異性；Western blot印證其與變性線形蛋白結合活性。 實驗結果： 1．HI186單克隆抗體對于CEM、LCL-H、HPB-ALL、REH等CD52陽性白血病細胞系在體外具有一定的生長抑制和促凋亡作用。 2．擴增HI186重鏈可變區(qū)基因342bp，m186輕鏈可變區(qū)基因339bp。 3．overlap-PCR構建包含linker的HI186ScFv單鏈抗體融合基因，全長為759bp，經酶切轉入pET22b質粒，構建pET22b／HI186-ScFv，在IPTG存在下可誘導高表達HI186-ScFv單鏈抗體融合蛋白。 4．抗體免疫競爭實驗表明HI186-ScFv單鏈抗體與原鼠源性HI186單克隆抗體具有相同的結合表位，可以抑制HI186單克隆抗體與細胞膜表面CD52天然抗原的結合，同時也可以結合變性的具有良好的結合活性和特異性。 實驗結論：HI186單克隆抗體生物學實驗表明對相應的白血病細胞系具有抑制生長作用，并且具有誘導凋亡作用。在成功構建了HI186-ScFv單鏈抗體的基礎上，應進一步研究其應用的可能性，并據(jù)此對其進行繼續(xù)改造。
[Abstract]:Objective: to study the biological function of murine anti-CD52 monoclonal antibody HI186. The preparation of HI186 single chain antibody (ScFv),) from mouse hybridoma combined with its biological function will lay a foundation for clinical treatment in the future. Methods: 1. To study the effect of monoclonal antibody against CD52 on some leukemia cell lines by using the method of fetal trypan blue staining to count living cells, MTT assay to detect living cells and Annexin V staining to detect specific apoptotic cells, etc. 2.RT-PCR method was used to clone mouse hybridoma HI186 antibody gene with light and heavy chain variable region gene. HI186-ScFv fusion gene was constructed by overlap-PCR method and cloned into prokaryotic expression vector pET22b,. Construction of Recombinant plasmid pET22b/HI186-ScFv. The recombinant plasmid was transfected into BL2 1 competent strain. In the presence of IPTG, the expression of HI186 scFv was induced. The fusion protein was renatured and purified. The binding activity of the fusion protein to the CD52 protein of natural cell membrane and the specific; Western blot activity were determined by flow cytometry to confirm the binding activity of the fusion protein to denatured linear protein. The results showed that 1.HI186 monoclonal antibody could inhibit the growth and promote apoptosis of CD52 positive leukemia cell lines such as CEM,LCL-H,HPB-ALL,REH in vitro. 2.Amplification of HI186 heavy chain variable region gene 342bpnm186 light chain variable region gene 339bp. HI186ScFv single chain antibody fusion gene containing linker was constructed by 3.overlap-PCR. The full length of the fusion gene was 759 BP. The fusion gene was digested into pET22b plasmid. PET22b/HI186-ScFv, could induce high expression of HI186-ScFv single chain antibody fusion protein in the presence of IPTG. 4. The immuno-competitive assay showed that HI186-ScFv single-chain antibody had the same binding epitope with proto-murine HI186 monoclonal antibody, and could inhibit the binding of HI186 monoclonal antibody to the natural CD52 antigen on the surface of cell membrane. At the same time, it can also bind to denaturation with good binding activity and specificity. Conclusion: HI186 monoclonal antibody can inhibit the growth and induce apoptosis of leukemia cell line. Based on the successful construction of HI186-ScFv scFv, the possibility of its application should be further studied and modified accordingly.
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

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本文編號：2401701