【摘要】：目的 構(gòu)建gAd 原核表達(dá)體系并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,對(duì)目的蛋白分離、純化、復(fù)性并測(cè)定其生物活性;同時(shí)構(gòu)建gAd 融合蛋白表達(dá)體系,完成對(duì)融合蛋白的純化。 方法 本研究首先分離健康人外周血淋巴細(xì)胞,用酚-氯仿法抽提基因組DNA,從Genbank 獲取脂聯(lián)素的基因序列,用Oligo 6.44 軟件設(shè)計(jì)引物,使其擴(kuò)增產(chǎn)物中包含脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域基因全部序列,PCR 產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠切膠回收純化,純化的擴(kuò)增產(chǎn)物和T 載體的連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,在氨芐陽(yáng)性平板中篩選白色菌落,擴(kuò)種后提取質(zhì)粒用酶切和PCR 鑒定,該質(zhì)粒命名為pMD18T-Ad。以pMD18T-Ad 為模板,設(shè)計(jì)合適引物,在上游引物中加入EcoR I 酶切位點(diǎn)和起始密碼,在下游引物中加入終止密碼和Pst I 酶切位點(diǎn),把上述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后與pBV220 經(jīng)EcoR I 和Pst I 雙酶切純化后的產(chǎn)物連接,把該質(zhì)粒命名為pBV220-gAd,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選出陽(yáng)性菌株,并經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步證實(shí),溫控誘導(dǎo)表達(dá),超聲破菌,包涵體的分離洗滌純化復(fù)性。復(fù)性后用超濾管離心濃縮,0.22μm 微孔濾膜過濾除菌,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量,把一定量的gAd注入高糖和高脂肪酸的兔體內(nèi),不同時(shí)間采血觀察其降低血糖和游離脂肪酸的效果。以pBV220-gAd 為模板通過PCR 方法構(gòu)建C 端含有His Tag 的pBV220-gAdhis 質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,用Western-blotting 鑒定,用Ni~(2+)-NTA 樹脂柱對(duì)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[Abstract]:Objective to construct a prokaryotic expression system of gAd and optimize the culture conditions to isolate, purify, refolding and determine its biological activity. At the same time, the expression system of gAd fusion protein was constructed, and the fusion protein was purified. Methods in this study, the peripheral blood lymphocytes of healthy people were isolated. The gene sequence of adiponectin from Genbank was extracted by phenol-chloroform method. Primers were designed with Oligo 6.44 software. The amplified product contained all the adiponectin globular domain genes. The PCR product was recovered and purified by low melting point agarose gel. The purified product was connected with T vector and transformed into JM109 receptive cells. White colonies were screened from positive plates of ampicillin. The plasmids were digested by enzyme and identified by PCR. The plasmid was named pMD18T-Ad.. Using pMD18T-Ad as template, suitable primers were designed, EcoR I restriction site and start code were added to upstream primer, and stop codon and Pst I restriction site were added to downstream primer. The above amplified products were recovered and purified by gelling gel and ligated with the products of pBV220 digested by EcoR I and Pst I. The plasmid was named pBV220-gAd, and transformed into Escherichia coli DH5 偽. The positive strains were screened out and further confirmed by sequencing. Temperature control induced expression, ultrasonic bacteriostasis, purification and renaturation of inclusion bodies. After renaturation, ultrafiltration tube was used to centrifuge concentration, 0.22 渭 m microporous membrane was used to filter bacteria, Coomassie brilliant blue method was used to determine protein content, and a certain amount of gAd was injected into rabbit with high sugar and high fatty acid. Blood samples were collected at different times to observe the effect of reducing blood glucose and free fatty acids. Using pBV220-gAd as template, pBV220-gAdhis plasmid containing His Tag in C terminal was constructed by PCR method and transformed into E. coli DH5 偽. The expression product was purified by Ni~ (2)-NTA resin column and identified by Western-blotting.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：Q78

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2400164