【摘要】： 目前治療急性中耳炎仍以使用抗生素為主要手段，但由于新型抗生素研發(fā)的相對滯后及臨床上常出現(xiàn)抗生素運(yùn)用的不當(dāng)，耐藥現(xiàn)象較為普遍。因此目前急性中耳炎患者存在治療周期長、效果差、費(fèi)用偏高等問題，不少病人反復(fù)發(fā)作，易形成慢性中耳炎。根據(jù)急性中耳炎感染的流行病學(xué)研究資料，研制針對中耳炎病原菌的疫苗，接種于急性中耳炎的易感人群，以期有效預(yù)防中耳炎的發(fā)生，將有望解決這一困惑。肺炎球菌是國內(nèi)外急性中耳炎發(fā)病的最主要致病菌。目前國內(nèi)已研制出肺炎球菌結(jié)合疫苗，但其使用的蛋白載體為破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素，在將來的臨床運(yùn)用中可能會面臨與破傷風(fēng)疫苗或白喉疫苗沖突等問題。肺炎球菌溶血素作為一種新型蛋白載體，具有各亞型肺炎球菌間交叉免疫保護(hù)作用等多方面的優(yōu)勢。本研究通過多糖蛋白偶聯(lián)技術(shù)、基因工程技術(shù)等成功研制出用于預(yù)防急性中耳炎的肺炎球菌多糖和肺炎球菌溶血素結(jié)合疫苗，并通過幼齡小鼠的接種試驗(yàn)，證明有較好的免疫原性。 第一部分肺炎球菌莢膜多糖與蛋白質(zhì)載體CEA結(jié)合疫苗的研制 目的探索和建立肺炎球菌莢膜多糖與蛋白質(zhì)載體結(jié)合疫苗的制備的適宜方法和條件，并通過幼齡小鼠的動物接種試驗(yàn)檢測其免疫原性，同時為今后檢測肺炎球菌多糖與溶血素結(jié)合疫苗的免疫原性制備包被抗原。 方法用19F型肺炎球菌多糖(PS)以氨基還原法分別與雞卵清蛋白(CEA)及牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)結(jié)合，以SepharoseCL-4B凝膠柱層析純化。PS-CEA結(jié)合物加入氫氧化鋁佐劑后制備成疫苗，PS-BSA結(jié)合物則用作本實(shí)驗(yàn)及以后研制肺炎球菌溶血素為載體的結(jié)合疫苗時ELISA法檢測抗PS抗體時包被酶標(biāo)板的包被抗原。分別以每次0.25μg、1.0μg、4.0μg 3種不同多糖含量的PS(19F)-CEA結(jié)合疫苗腹腔注射3周齡幼小鼠，每隔1周復(fù)種1次，接種第3次后7天采血。多糖疫苗對照組幼小鼠以19F型肺炎球菌多糖疫苗接種(每次4.0μg)，陰性對照組以0.15M PBS注射。用ELISA法檢測小鼠血清中抗肺炎球菌多糖抗體水平。 結(jié)果經(jīng)SepharoseCL-4B凝膠柱層析洗脫后肺炎球菌多糖與蛋白CEA或BSA結(jié)合物的A_(280)峰值位置均較多糖及載體蛋白的各自峰值位置明顯前移。以多糖含量分別為0.25μg、1.0μg、4.0μg的結(jié)合疫苗接種的3組幼小鼠血清中抗肺炎球菌多糖抗體IgG的幾何平均滴度(GMT)分別為18.05、28.85、36.09，多糖疫苗對照組為7.70，陰性對照組為5.69。多糖疫苗對照組抗體水平無明顯增高(P＞0.05)， 3組結(jié)合疫苗實(shí)驗(yàn)組抗體水平均明顯增高(P＜0.001)。 結(jié)論已成功建立制備肺炎球菌多精蛋白結(jié)合疫苗的適宜方法和條件，該疫苗能在幼齡小鼠體內(nèi)引起明顯的免疫應(yīng)答。 第二部分基因工程技術(shù)制備肺炎球菌溶血素 目的制備肺炎球菌溶血素，為研制肺炎球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗提供新型的蛋白載體。 方法根據(jù)Walker等1987年報道的肺炎球菌溶血索(Ply)基因序列(GenBank accession no．X52474)，設(shè)計一對帶有兩個限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，運(yùn)用PCR的方法，從肺炎球菌的染色體DNA中擴(kuò)增出Ply的基因。對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行酶切、回收，再將其克隆入表達(dá)載體pET-28a質(zhì)粒中，用此基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(DE3)宿主細(xì)胞，并以IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過超聲波破菌收集蛋白，對所得蛋白質(zhì)用固相Ni-NTA樹脂作親和吸附純化，再用SDS-PAGE電泳法鑒定表達(dá)的純化基因重組Ply蛋白(rPly)。 結(jié)果通過常規(guī)克隆方法和PCR技術(shù)成功克隆Ply基因，，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序分析證實(shí)。成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，蛋白表達(dá)的產(chǎn)物相對分子量為52KDa，經(jīng)純化后的rPly蛋白純度達(dá)到90％以上。 結(jié)論可通過基因工程技術(shù)克隆Ply基因并進(jìn)行蛋白表達(dá)而獲得肺炎球菌溶血素，采用固化鎳樹脂親和純化技術(shù)所得Ply蛋白的純度可滿足于用作蛋白質(zhì)載體和酶標(biāo)檢測包被抗原的要求。 第三部分肺炎球菌莢膜多糖與肺炎球菌溶血素結(jié)合疫苗的制備及免疫原性研究 目的研制肺炎球菌19F型莢膜多糖與肺炎球菌溶血素(蛋白)偶聯(lián)結(jié)合疫苗，并檢測其在幼齡動物體內(nèi)的免疫原性。 方法先用福爾馬林將通過基因工程技術(shù)制備得到的肺炎球菌溶血素脫毒，去除其溶血活性，再用19F型肺炎球菌莢膜多糖(PS)以氨基還原法與之偶聯(lián)結(jié)合，以SepharoseCL-4B凝膠柱層析純化。將純化后的結(jié)合物與鋁佐劑混合制成疫苗。以該疫苗腹腔注射接種3周齡幼小鼠，劑量為3μg多糖含量／次，每周接種1次，接種1～3次。陰性對照組小鼠腹腔注射等量0.15M PBS。接種完成后用ELISA法檢測小鼠血清中抗PS及抗Ply的IgG抗體水平。 結(jié)果Ply經(jīng)福爾馬林脫毒后失去溶血活性。19F PS-PIy結(jié)合物經(jīng)SepharoseCL-4B凝膠層析柱沈脫、純化，其洗脫峰位置較19F PS與Ply二者的峰值位置均明顯前移。用該結(jié)合疫苗免疫的幼齡小鼠接種1次、2次、3次時血清中抗PS(19F)抗體IgG的GMT分別為32.25、42.07、72.41，陰性對照組為8.9(P值均＜0.001)：抗Ply抗體IgG的GMT分別為36.21、80.71、138.3，對照組為22.37(P＜0.01或P＜0.001)。接種1～3次時兩種抗體效價均明顯高于陰性對照組。 結(jié)論用基因工程技術(shù)制備的肺炎球菌溶血素以福爾馬林脫毒后作為蛋白載體與肺炎球菌莢膜多糖偶聯(lián)結(jié)合，制成的結(jié)合疫苗能在幼齡小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出明顯的針對PS和Ply的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R764

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 吳建勇;金黃色葡萄球菌表面多糖偶聯(lián)抗原的制備及其免疫原性分析[D];石河子大學(xué);2011年

本文編號：2393204