【摘要】： 腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7是一種重要的新發(fā)人畜共患傳染病病原菌。自1975年被首次分離、1982年被確認(rèn)為致病菌以來的近30年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157：H7感染可使人產(chǎn)生多種并發(fā)癥，其中以溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremic syndrome，HUS)危害最為嚴(yán)重，可導(dǎo)致死亡。我國已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀(jì)可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。同時，O157：H7菌培養(yǎng)容易、繁殖迅速、感染力強(qiáng)、感染途徑廣泛，使之極有可能作為未來軍事斗爭中的細(xì)菌戰(zhàn)劑和生物恐怖戰(zhàn)劑。 目前，對EHEC O157：H7感染仍缺乏有效的治療方法。臨床上針對其感染主要采用抗生素治療及相應(yīng)的對癥治療。新近的研究發(fā)現(xiàn)，抗生素使菌體破裂，導(dǎo)致O157：H7菌志賀毒素(Shiga toxin，Stx)的釋放水平大大提高，使用抗生素有可能加重病情，增加發(fā)生并發(fā)癥的危險并引起死亡。而針對Stx的特異性抗體可能會在治療該菌感染上，發(fā)揮較大的作用。 EHEC O157：H7主要產(chǎn)生兩種毒素，分別稱為志賀毒素Ⅰ(Stx1)和志賀毒素Ⅱ(Stx2)。兩種毒素均由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞單位具有細(xì)胞內(nèi)毒性，能與28S rRNA作用從而抑制蛋白質(zhì)合成；B亞單位具有細(xì)胞結(jié)合特性，能與具有特定糖鞘脂受體(Gb_3)的細(xì)胞結(jié)合，從而引導(dǎo)A亞單位發(fā)揮作用。研究證實(shí)Stx2毒性強(qiáng)于Stx1，與溶血性尿毒綜合癥(HUS)等嚴(yán)重并發(fā)癥的相關(guān)性更為密切。因此Stx2是該菌致病性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是理想的制備中和毒素的特異性抗體的靶抗原。 同時，獲得天然的Stx2是研究其毒性作用機(jī)理、篩選更有效的疫苗候選靶點(diǎn)、制備特異的基因工程抗體、解析其蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等的先決條件。運(yùn)用單克隆抗體親和層析法是純化目標(biāo)蛋白的特異有效途徑。 基于以上認(rèn)識，本研究從以下幾個方面進(jìn)行抗志賀毒素ⅡB亞基(Stx2B)單抗的研制及其親和層析的研究 1．抗志賀毒素ⅡB亞單位(Stx2B)單克隆抗體的制備與鑒定 方法以融合蛋白EspA-Stx2B作為抗原，免疫Balb／c小鼠，以未免疫的Balb／c小鼠脾細(xì)胞為飼養(yǎng)細(xì)胞；運(yùn)用細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備，運(yùn)用間接ELISA法篩選產(chǎn)生針對Stx2B的單克隆抗體細(xì)胞株；體內(nèi)誘生法產(chǎn)生腹水，飽和硫酸銨沉淀法初步純化，再采用HiTrap rProtein A柱進(jìn)一步純化；Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit鑒定McAb的Ig亞型，采用間接ELISA法鑒定抗體親和常數(shù)，進(jìn)行Vero細(xì)胞毒性保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果獲得3株產(chǎn)生針對Stx2B的單克隆抗體細(xì)胞株1H9、1H10、3E5，Ig亞型分別為IgG_1κ型，IgG_(2a)κ型，，IgG_(2b)κ型，親和力常數(shù)分別為7．36×10~8、6．94×10~8、5．85×10~8。3株單抗在體外均能中和Stx2毒素，抑制Stx2對Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，與無關(guān)抗體1D6比較，差異極顯著，p0．01；同等劑量的抗體，抑制率不同，1H101H93E5，無顯著差異，p0．05；50％抑制率時3株單抗的劑量約為0．2-0．3μg。結(jié)論3株細(xì)胞株產(chǎn)生的抗Stx2B單抗均具有一定的中和活性，中和活性最強(qiáng)的為1H_(10)。 2．抗志賀毒素B亞單位單克隆抗體識別表位的初步鑒定 方法運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對Stx2B(1-72aa)全蛋白進(jìn)行表位預(yù)測，選取Stx2B全蛋白的23aa和54aa位置作為截短位點(diǎn)；從EHEC O157：H7 EDL933基因組中擴(kuò)增Stx2B50(23-72aa)和Stx2B54(1-54aa)，克隆于pET-22b(+)載體，轉(zhuǎn)化到工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Tris-Tricine-PAGE蛋白電泳及Western blot分析。結(jié)果McAb 1H_9和1H_(10)能夠識別Stx2B和Stx2B50；McAb 3E_5能夠識別Stx2B、Stx2B50和Stx2B54。結(jié)論McAb 1H9、1H_(10)識別的抗原表位位于55-72aa，McAb 3E_5識別的抗原表位位于23-54aa。 3．免疫親和層析純化天然志賀毒素Ⅱ(Stx2) 方法將McAb 1H_(10)與CNBr-activated Sepharose 4B填料偶聯(lián)，制備免疫親和層析柱；用絲裂酶素C誘導(dǎo)EHEC O157：H7 99A021表達(dá)Stx2，以其培養(yǎng)上清制成Stx2初提物；初提物上柱進(jìn)行純化，并用多種方法鑒定純化產(chǎn)物。結(jié)果純化后樣品進(jìn)行SDS-PAGE，在32KD和8KD處明顯看見蛋白條帶，免疫印跡、Duopath Verotoxins Kit、細(xì)胞毒性試驗(yàn)(CD_(50)為2pg)和動物攻毒試驗(yàn)(LD_(100)為5ng)鑒定出該純化蛋白為天然Stx2。結(jié)論應(yīng)用免疫親和層析成功純化出天然Stx2。 綜上所述，本研究獲得了具有毒素中和活性的抗Stx2B單克隆抗體，對其抗原識別表位進(jìn)行了初步鑒定，建立了免疫親和層析方法，成功純化出天然Stx2，為以后的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2386798