發(fā)布時間：2018-12-18 19:57

【摘要】： 目的:構建含沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)蛋白酶樣活性因子(chlamydial protease-like activity factor, CPAF)免疫活性區(qū)(200～338 aa)基因的重組表達體,在大腸桿菌中進行誘導表達,純化表達產物并進行免疫原性和抗原性分析,建立間接ELISA法和IIF法檢測Ct感染的臨床標本,分析其敏感性和特異性,為制備Ct臨床檢測試劑盒奠定基礎。 方法:通過生物信息學分析和查閱資料,篩選并挑選Ct CPAF基因優(yōu)勢抗原表位,以D型Ct基因組DNA為模板,高保真聚合酶鏈反應擴增目的片斷,將其亞克隆至原核表達載體pGEX-6p-2中,構建重組質粒pGEX-6p-2/CPAF,然后轉化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中進行誘導表達,利用SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定表達產物;重組蛋白經稀釋透析復性后,用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱進行純化,紫外吸收法測定純化蛋白濃度。用純化的Ct CPAF重組蛋白包被微孔板,建立間接ELISA方法,檢測Ct參比血清和臨床Ct陽性血清,同時與晶美公司Ct ELISA試劑盒檢測結果進行對比分析,根據(jù)重組蛋白與Ct陰、陽性血清的反應情況,評價該重組抗原在Ct感染血清學診斷中的應用價值。同時用純化的Ct CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔,間接ELISA方法檢測免疫兔血清中Ct CPAF多克隆抗體的效價;并用溴化氰活化的瓊脂糖凝膠4B對抗血清進行純化,純化后的抗血清作為一抗建立間接ELISA法和IIF法測定臨床分泌物標本中的Ct CPAF抗原,與PCR法檢測結果進行對比分析,評價該抗血清在臨床標本抗原檢測中的應用價值。 結果:軟件分析Ct CPAF基因的抗原表位選擇了Ct CPAF基因的674～1 090bp位堿基序列為目的基因(片段長度為417bp,編碼139個氨基酸);PCR擴增得到大小約為400bp的目的片斷;構建的重組質粒經酶切鑒定和測序鑒定證明其中插入片斷為Ct CPAF目的基因,測序結果與Genbank上登錄序列完全一致;SDS-PAGE分析顯示,在IPTG誘導下,重組表達菌表達了一相對分子量(Mr)約為43×103的目的蛋白條帶,目的蛋白在菌體細胞內主要以包涵體形式存在;經GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化獲得了純度在95%以上的重組蛋白。Western-blot檢測其能與Ct陽性血清發(fā)生特異性反應;重組蛋白為包被抗原建立間接ELISA法檢測Ct參考血清,其陰、陽性符合率均為100%;用自建的間接ELISA法和晶美公司Ct ELISA試劑盒分別檢測250份陰、陽性血清,兩種方法的符合率IgM為96.8%,IgG為98.4%。利用純化的Ct CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔,間接ELISA法測定兔免疫血清特異性抗體效價在1:16 000以上;純化后的抗血清作為一抗建立間接ELISA法和IIF法檢測臨床分泌物標本中的Ct CPAF抗原,建立的間接ELISA法及IIF法與上海復星公司Ct PCR試劑盒檢測結果符合率分別為91.90%和90.00%。 結論: 1、成功構建了pGEX-6p-2/ CPAF原核表達體,將其轉化至E.coli BL21(DE3)后表達出了一相對分子量(Mr)約為43×103的重組蛋白; 2、Ct CPAF重組蛋白具有較好的免疫原性,能刺激新西蘭兔產生高效價的特異性抗體; 3、Ct CPAF重組蛋白具有良好的抗原性,能與Ct感染者陽性血清特異性結合,可應用于Ct血清學診斷; 4、以Ct CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔制備的多克隆抗體為一抗建立的間接ELISA法和IIF法具有良好的敏感性和特異性,可望應用于Ct感染的抗原檢測。
[Abstract]:Objective: To construct a recombinant expression of the immunoactive region (200-338aa) of the immunoactive region (200-338aa) of Chlamydia trachomatis (Ct) protease-like activity factor (CPAF), to induce expression in E. coli, to purify and express the product and to analyze the immunogenicity and antigenicity. To establish the indirect ELISA and the IIF method to detect the clinical specimens of Ct infection, the sensitivity and specificity were analyzed, and the basis for preparing the Ct clinical test kit was established. Methods: Through the analysis of bioinformatics and the data, screening and selection of the positive antigen epitope of the Ct CPAF gene, using the D-type Ct genomic DNA as the template and the high-fidelity polymerase chain reaction to amplify the target fragment, subcloning it into the prokaryotic expression vector pGEX-6p-2, and constructing the recombinant plasmid pGEX-6p-2. 2/ CPAF, and then transformed into E. coli BL21 (DE3) to be expressed, analyzed and identified by SDS-PAGE and Western-Blot, and the recombinant protein was subjected to dilution and renaturation, and purified by using a GST agarose gel FF purification column, and the ultraviolet absorption method purifying the protein concentration, coating the microporous plate with the purified Ct CPAF recombinant protein, establishing an indirect ELISA method, detecting the Ct reference ratio serum and the clinical Ct positive serum, and carrying out contrast analysis with the detection result of the Ct ELISA kit of the crystal beauty company, and according to the recombinant protein and the Ct negative and the positive blood, A clear response to evaluate the serologic diagnosis of the recombinant antigen in the Ct infection Use of purified Ct CPAF recombinant protein to immunize New Zealand rabbit, indirect ELISA method to detect the titer of Ct CPAF polyclonal antibody in immune rabbit serum, and use cyanogen bromide to activate agarose gel 4B. The serum was purified, the purified antiserum was used as an anti-establishing indirect ELISA method and the IIF method to measure the Ct CPAF antigen in the clinical secretion specimen, and compared with the detection result of the PCR method, the antiserum was evaluated for clinical specimen antigen detection. The results are as follows: The software analyzes the epitope of the Ct CPAF gene, and the target gene (the length of the fragment is 417bp, encodes 139 amino acids) is selected by the antigen table of the Ct CPAF gene, and the PCR amplification is large. The results showed that the inserted fragment is the target gene of Ct CPAF, and the sequencing result is completely consistent with the log-in sequence on Genbank; and the SDS-PAGE The analysis showed that, under the induction of IPTG, the recombinant expression bacteria expressed a target protein band with a relative molecular weight (Mr) of about 43-103, and the target protein was mainly in the form of inclusion bodies in the bacterial cells; and the purified column was purified by the GST agarose gel FF purification column. The purity of the recombinant protein was over 95%. Western-blot was used to detect the specific reaction with the positive serum of Ct. The recombinant protein was an indirect ELISA method for the detection of Ct reference serum. The positive rate of negative and positive was 100%. The coincidence rate of the two methods was 96% and the rate of the positive serum was 96. 8% and 98. 4% of IgG. The purified Ct CPAF recombinant protein was used to immunize New Zealand rabbits, and the indirect ELISA method was used to determine the specific antibody titer of the rabbit immune serum at 1: 16,000. The purified antiserum was used as an anti-establishment indirect ELISA method and the IIF method to detect the clinical secretion. The coincidence rate of Ct CPAF antigen, the established indirect ELISA method and the IIF method and the detection result of the Ct PCR kit of Shanghai Fuxing Co., Ltd. 91. Conclusion: 1. The pGEX-6p-2/ CPAF prokaryotic expression was successfully constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3). The expression of a relative molecular weight (Mr) is about 43-103 recombinant protein; 2, Ct CP The AF recombinant protein has better immunogenicity and can stimulate the high-efficiency specific antibody of the New Zealand rabbit; and 3, the Ct CPAF Reorganization The protein has good antigenicity, can be specifically combined with the positive serum of a Ct-infected person, can be applied to the serological diagnosis of Ct,
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R374;R446.6

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 黃傳啟;;什么是噬菌體、病原體、沙眼衣原體?[J];生物學通報;1990年01期

2 張津萍,鐘銘英,張樹文,王千秋;沙眼衣原體酶免疫法和細胞培養(yǎng)法的比較[J];中國皮膚性病學雜志;2004年05期

3 ;微生物的奇異繁殖方式[J];大科技(科學之迷);2006年03期

4 沐桂藩,呂華,徐如良,顧方舟;分泌抗沙眼衣原體單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立[J];中國免疫學雜志;1989年04期

5 劉光橋;馬力;宋立華;朱虹;端青;;沙眼衣原體L2型主要外膜蛋白的原核表達及其抗原性分析[J];微生物學免疫學進展;2008年01期

6 陳萬山,曾泳而;介紹使用clearview衣原體試劑盒檢測沙眼衣原體的方法[J];廣州醫(yī)藥;1996年04期

7 李紅,劉全忠;沙眼衣原體疫苗研究的新進展[J];國外醫(yī)學.皮膚性病學分冊;2004年02期

8 劉良專;吳移謀;;衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應蛋白研究進展[J];中國人獸共患病學報;2009年04期

9 倪安平，李永哲;抗沙眼衣原體主要外膜蛋白種特異性單克隆抗體[J];中國醫(yī)學科學院學報;1995年06期

10 鄭占才,王家璧,劉躍華,王宏偉,王曉峰;PCR 與 DIFA 檢測沙眼衣原體的比較研究[J];中國性病艾滋病防治;1997年03期

相關會議論文 前10條

1 盛彩虹;劉原君;齊蔓麗;劉全忠;;E型沙眼衣原體主外膜蛋白DNA疫苗和重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫誘導出的免疫效應[A];中華醫(yī)學會第16次全國皮膚性病學術年會摘要集[C];2010年

2 吳仁孝;相軍;劉官信;;新生兒沙眼衣原體結膜炎[A];新世紀全國首屆小兒綜合研究學術會議論文匯編[C];2001年

3 鄭英如;李力;胡珊;郭建新;顏耀華;;女性生殖道沙眼衣原體和解脲支原體感染與輸卵管性不孕癥的關系的研究[A];第八次全國婦產科學學術會議論文匯編[C];2004年

4 黃祝娟;;225例盆腔炎患者解脲支原體及沙眼衣原體的檢測及療效分析[A];中華醫(yī)學會第十二次全國皮膚性病學術會議論文集[C];2006年

5 葉興東;戴向農;黎小東;余丹丹;費實;湯少開;黃雪梅;任澤舫;朱慧蘭;;測序法對廣州地區(qū)沙眼衣原體omp1基因分型及突變研究[A];中華醫(yī)學會第16次全國皮膚性病學術年會摘要集[C];2010年

6 邢衛(wèi)斌;彭軍;馬冬梅;門劍龍;;UF-100尿沉渣全自動檢測儀檢測體外抗菌素抗衣原體活性[A];全國性與生殖醫(yī)學學術研討會論文匯編[C];2004年

7 俞小元;;沙眼衣原體和解脲支原體感染的探討[A];紀念卓越的人民醫(yī)學家林巧稚大夫誕辰100周年——全國婦產科高級學術論壇論文集[C];2001年

8 嚴軍;尤學平;;生殖道沙眼衣原體感染垂直傳播臨床觀察[A];全國中西醫(yī)結合生殖健康學術研討會論文及摘要集[C];2004年

9 邢衛(wèi)斌;牟兆新;秦蘭英;王秀麗;劉全忠;;UF-100型全自動檢測分析儀檢測沙眼衣原體的探索[A];中華醫(yī)學會第十二次全國皮膚性病學術會議論文集[C];2006年

10 劉全中;楊士強;傅志宜;王樹椿;繳穩(wěn)玲;田靜群;;遷延難愈沙眼衣原體泌尿生殖道感染——幾種抗生素的療效評定和隨訪[A];2002中國中西醫(yī)結合皮膚性病學術會議論文匯編[C];2002年

相關重要報紙文章 前10條

1 凹凸;沙眼衣原體可致不孕[N];大眾衛(wèi)生報;2001年

2 柯春榮;沙眼衣原體可導致不孕[N];大眾衛(wèi)生報;2003年

3 江錦琦;女性感染沙眼衣原體可致不孕[N];中國中醫(yī)藥報;2001年

4 劉成剛　左朝勝;復能與羅氏攜手人類重組蛋白研發(fā)[N];科技日報;2006年

5 葉國標;為國家一級產業(yè)化項目找婆家[N];醫(yī)藥經濟報;2001年

6 白毅;我國首獲旋毛蟲新基因[N];中國醫(yī)藥報;2005年

7 許永杰;過度清潔亦惹禍[N];中國體育報;2001年

8 段煉煉邋葉頌濤;雙鷺藥業(yè)(002038) 進入高成長期可謂水到渠成[N];中國證券報;2007年

9 李寧 張磊 湯;基因工程新藥的誕生將在制藥業(yè)掀起一場革命[N];大眾科技報;2006年

10 白毅;生物技術藥物研發(fā)：百舸爭流競上游[N];中國醫(yī)藥報;2007年

相關博士學位論文 前10條

1 李曉霞;基因重組蛋白誘導多能干細胞基礎研究[D];暨南大學;2011年

2 常華;鴨瘟病毒gE基因功能初步研究[D];四川農業(yè)大學;2011年

3 劉雙全;梅毒螺旋體Tp0751黏附蛋白的免疫活性及在梅毒致病中的作用研究[D];中南大學;2010年

4 陳禮文;人CD83分子單克隆抗體與重組蛋白制備及其抑制T細胞功能的機制研究[D];蘇州大學;2011年

5 粟玉珍;沙眼衣原體熱休克蛋白60與免疫致病[D];中國醫(yī)科大學;2002年

6 郭一帆;人類白細胞抗原G5對胚胎滋養(yǎng)層細胞侵襲能力及子宮內膜上皮細胞容受性的調控[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2013年

7 林昕;基于活性探針分子對代謝型γ-氨基丁酸受體激活機制的研究[D];華中科技大學;2010年

8 郝軍元;凋亡素重組蛋白導向治療腫瘤的研究[D];吉林大學;2006年

9 楊君;Xenorhabdus budapestensis D43菌株殺蟲蛋白的分離純化及致病機理的研究[D];安徽農業(yè)大學;2012年

10 許麗萍;脂蛋白（a）與A群鏈球菌的相互作用[D];內蒙古農業(yè)大學;2010年

相關碩士學位論文 前10條

1 劉雙全;梅毒螺旋體Tp0453重組蛋白的表達、純化及免疫活性研究[D];南華大學;2005年

2 張海英;矮牽�；ㄏ慊駼SMT3cDNA克隆與原核表達[D];四川大學;2007年

3 李玉彬;重組人心肌肌鈣蛋白Ⅰ基因工程菌的構建[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2007年

4 郭元元;外源性S100A8對宮頸癌細胞系Hela的生物學作用及機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

5 喬偉振;丙型肝炎病毒不同基因型不同區(qū)域重組蛋白的抗原性分析及應用[D];東南大學;2004年

6 劉娟;人甲狀旁腺激素在大腸桿菌中的表達[D];昆明理工大學;2005年

7 畢立清;抗人胰島素樣生長因子-1單克隆抗體的制備與鑒定[D];南京醫(yī)科大學;2008年

8 朱潔;重組人Bikunin結構域Ⅰ在畢赤酵母中表達的研究[D];吉林大學;2009年

9 劉大斌;抗-αvβ3scFv-sTF雙功能融合蛋白的可溶性表達及其特性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2010年

10 江文才;華支睪吸蟲半胱氨酸蛋白酶基因克隆、表達及血清學診斷效果評價[D];江蘇省血吸蟲病防治研究所;2011年

，

本文編號：2386413