【摘要】： 目的NK細胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應細胞,具有廣泛的生物學功能,位于機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線;不需要預先刺激即可識別并殺傷腫瘤和病毒感染的細胞,同時又能通過早期分泌多種細胞因子(如IFN-γ、GM-CSF和TNF-β)和趨化因子來調節(jié)獲得性免疫應答,因此,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細胞及其分泌的細胞因子不僅參與調節(jié)天然免疫和獲得性免疫,而且參與調節(jié)造血系統(tǒng)的功能,在血液系統(tǒng)疾病,尤其是異基因骨髓移植中,在抑制和預防GVHD,促進GVT效應和促進血液和免疫系統(tǒng)重建方面起重要作用。同時,NK細胞對自身免疫性疾病的調節(jié)亦引起了人們的重視。因此,盡管關于NK細胞的發(fā)育分化和識別功能的研究遠遠滯后于T細胞和B細胞,近年來,關于NK細胞功能和調節(jié)的研究引起了人們極大的興趣,并有了突飛猛進的發(fā)展,成為免疫學研究的一大熱點。 近期的研究發(fā)現(xiàn),NK細胞表面存在識別靶細胞表面分子的活化受體和抑制性受體,NK細胞的效應功能取決于活化信號與抑制性信號的綜合。抑制性受體能特異性識別靶細胞表面的MHC-I類分子并保護正常細胞不被殺傷,人的NK細胞抑制性受體主要有殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell Ig-like receptors, KIR)和凝集素樣受體CD94/NKG2A,在調節(jié)NK細胞功能方面起重要作用�；罨荏w識別經(jīng)典、非經(jīng)典的MHC-I類分子或MHC-I類相關分子,在NK活化的啟動方面起關鍵作用,其中尤為引人注目的是NKG2D,NKG2D的配基為非經(jīng)典的MHC樣分子MICA (MHC class I chain-related protein A)、MICB及ULBP -1,2,3,4(UL16-binding protein-1,2,3,4),這些分子在許多上皮及非上皮來源的腫瘤細胞、病毒感染細胞和受到“應激性刺激”的細胞均有表達或上調。研究表明,NKG2D的單獨活化即足以刺激NK細胞的活化,并能克服抑制性受體的強勢信號,因此,在NK細胞活化過程中起著舉足輕重的作用。而NKG2D配體的表達水平,可能決定著NKG2D的活化與否。目前,對MICA的結構與功能,以及與疾病關系等方面的研究都取得重要進展,但對其表達調控機制的研究卻很少。干擾素是機體抗腫瘤免疫應答的重要免疫調節(jié)劑。I型干擾素(IFN-α和IFN-β)具有抑制病毒復制、抑制細胞增殖、抗腫瘤等多種生物學功能。II型干擾素(IFN-γ),又稱免疫干擾素,是由Th1細胞和NK細胞分泌的多功能性細胞因子,是重要的免疫應答調節(jié)劑,能激活單核巨噬細胞,誘導多種細胞表達MHC I類和II類分子而增強抗原遞呈,促進Th0細胞向Th1分化等。IFN-α是經(jīng)典的NK細胞活化劑,已廣泛用于多種實體瘤和病毒性肝炎的治療,但IFN-γ對腫瘤的臨床療效卻不盡如人意。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)IFN-α和IFN-γ對NK細胞受體的調節(jié)作用是相反的,IFN-α可上調活化性受體NKG2D表達,下調抑制性受體NKG2A表達,而IFN-γ的作用則恰恰相反。MICA和MICB5’側翼區(qū)均含有一段與熱休克蛋白70基因啟動子熱休克應答元件相似的調控序列,基因在應激條件下的誘導表達與該序列的活化有關,上調MICA表達的應激刺激亦能上調HSP70的表達。最近研究發(fā)現(xiàn),IFN-α可上調HSP70的表達,而IFN-γ下調HSP70表達;IFN-α可誘導樹突狀細胞表達MICA分子;金屬基質蛋白酶(MMPs)的剪切作用可削弱細胞膜表面MICA分子的表達,而IFN-γ可增強MMPs的剪切功能。因此推測兩者可能對人腫瘤細胞NKG2D配體MICA分子的表達在多級水平存在相反的調節(jié)作用。 本研究中,我們首先觀察了IFN-α和IFN-γ對人宮頸癌細胞(HeLa和Caski)及血液系統(tǒng)腫瘤(K562和Raji)MICA表達的影響,并且觀察了MICA表達的變化對NK細胞識別與殺傷的影響,以期探討IFN-α和IFN-γ是否相反地調節(jié)了MICA的表達,并影響了腫瘤細胞對NK細胞殺傷的敏感性。進一步,我們構建了pGL3/MICA-promoter螢光報告重組載體,觀察了IFN-α和IFN-γ是否通過調節(jié)MICA啟動子轉錄活性影響MICA的表達。同時,觀察了IFN-γ能否通過增強金屬基質蛋白酶的剪切功能而使腫瘤細胞的膜結合型MICA脫落形成可溶性MICA。從而在轉錄水平和翻譯后水平兩方面探討MICA表達的調控機制。 方法 1.RT-PCR法檢測MICA mRNA的表達 2.免疫組化法鑒定MICA蛋白的表達 3.MTT法檢測人外周血NK細胞對腫瘤細胞的殺傷 4.MICA啟動子克隆載體的構建: 酚氯仿法提取基因組DNA,PCR法擴增MICA啟動子序列,與pMD18-T連接,構建MICA啟動子克隆載體,進行DNA序列測定。 5. pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組載體的構建:應用限制性內切酶將MICA啟動子序列從克隆載體上切下來,連接到螢光報告基因載體pGL3-basic上,構建pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組載體。 6.MICA啟動子活性的檢測:以pLR-TK作為轉染效率內參照,分別與pGL3-basic、pGL3-control、pGL3/MICA-promoter質粒通過脂質體共轉染到腫瘤細胞中,參照雙螢光報告基因系統(tǒng)操作手冊(Promega),裂解細胞,synergy HT多功能酶標儀檢測螢光素酶活性。 7. RT-PCR法檢測基質金屬蛋白酶及其組織抑制物的表達。 8. ELISA法檢測培養(yǎng)上清中可溶性MICA的含量。 結果 1.IFN-α和IFN-γ對腫瘤細胞MICA表達水平的不同影響RT-PCR結果顯示,人宮頸癌細胞Hela和人紅白血病細胞K562 MICA表達陽性,人宮頸癌細胞Caski為弱陽性,人Burkitt淋巴瘤細胞Raji為陰性。IFN-α對MICA(+)和MICA(-)腫瘤細胞MICA mRNA的表達均有增強作用;而IFN-γ則抑制MICA(+)腫瘤細胞MICA mRNA的表達。免疫組化結果顯示IFN-α和IFN-γ對腫瘤細胞表面MICA分子的蛋白表達水平具有相反的調節(jié)作用。 2.IFN-α和IFN-γ影響腫瘤細胞對外周血NK細胞殺傷的敏感性IFN-α1000u/ml可明顯上調MICA(+)和MICA(-)腫瘤細胞對外周血NK細胞殺傷的敏感性;IFN-γ1000u/ml則可下調MICA(+)腫瘤細胞對外周血NK細胞殺傷的敏感性�？贵w阻斷實驗顯示MICA表達水平的變化與NK細胞殺傷活性變化密切相關。 3.MICA啟動子序列的克隆提取新鮮培養(yǎng)的HeLa細胞的基因組DNA,以MICA啟動子序列的特異引物進行PCR反應,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后,與pMD18-T載體連接、酶切鑒定后測序,證實已獲得的DNA為MICA啟動子序列,結果與文獻報道一致。 4.pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組載體的構建用HindIII和XhoI從克隆載體pMD18-T/MICA-promoter切下MICA啟動子片段,與經(jīng)相同雙酶切的pGL3-basic質粒進行粘端連接。產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109 ,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽性的克隆即為構建好的pGL3/MICA-promoter螢光報告重組載體。 5.IFN-α和IFN-γ對MICA啟動子活性的影響用脂質體將構建好的pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組質粒和作為轉染效率內參照的pRL-TK質粒共轉染到HeLa和Caski細胞中,分別以IFN-α和IFN-γ1000u/ml誘導48h,裂解細胞,雙螢光報告基因檢測系統(tǒng)檢測裂解產(chǎn)物中螢光素酶的活性。結果顯示,IFN-α1000 u/ml誘導48h可顯著提高MICA啟動子轉錄活性,但未觀察到IFN-γ對MICA啟動子轉錄活性的影響。 6.IFN-α和IFN-γ對可溶性MICA分子釋放的影響RT-PCR結果顯示,IFN-γ上調基質金屬蛋白酶9(MMP9)和膜型基質金屬蛋白酶2(MT2-MMP)的表達,并下調基質金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)的表達,但未發(fā)現(xiàn)IFN-α對兩者表達變化的影響。進一步用ELISA檢測HeLa和K562細胞培養(yǎng)上清中可溶性MICA含量的變化,發(fā)現(xiàn)IFN-γ1000u/ml誘導48h可明顯提高上清中可溶性MICA的水平。 結論 1.IFN-α上調了腫瘤細胞中MICA mRNA和蛋白的表達,繼而增強NK對其識別與殺傷。 2.IFN-γ下調了腫瘤細胞中MICA mRNA和蛋白的表達,繼而降低NK對其識別與殺傷。 3. IFN-α通過增強MICA啟動子活性而從轉錄水平上調MICA基因的表達。 4.IFN-γ通過增強基質金屬蛋白酶的剪切作用,降低了膜表面MICA的表達。 本研究首次提出了,IFN-α和IFN-γ對人腫瘤細胞NKG2D配體MICA分子的表達具有相反的調節(jié)作用,進一步探討了兩者對NKG2D受配體系統(tǒng)的影響的機制,為研究NK細胞殺傷機制和腫瘤免疫逃逸機制提供了依據(jù),為促使活化性和抑制性信號的平衡向活化方向傾斜,增強機體抗腫瘤能力提供了新的策略。
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【學位授予單位】：山東省醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2376634