【摘要】： 目的NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,具有廣泛的生物學(xué)功能,位于機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線;不需要預(yù)先刺激即可識別并殺傷腫瘤和病毒感染的細(xì)胞,同時又能通過早期分泌多種細(xì)胞因子(如IFN-γ、GM-CSF和TNF-β)和趨化因子來調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答,因此,是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。NK細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子不僅參與調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫,而且參與調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)的功能,在血液系統(tǒng)疾病,尤其是異基因骨髓移植中,在抑制和預(yù)防GVHD,促進(jìn)GVT效應(yīng)和促進(jìn)血液和免疫系統(tǒng)重建方面起重要作用。同時,NK細(xì)胞對自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)亦引起了人們的重視。因此,盡管關(guān)于NK細(xì)胞的發(fā)育分化和識別功能的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于T細(xì)胞和B細(xì)胞,近年來,關(guān)于NK細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)的研究引起了人們極大的興趣,并有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,成為免疫學(xué)研究的一大熱點。 近期的研究發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞表面存在識別靶細(xì)胞表面分子的活化受體和抑制性受體,NK細(xì)胞的效應(yīng)功能取決于活化信號與抑制性信號的綜合。抑制性受體能特異性識別靶細(xì)胞表面的MHC-I類分子并保護正常細(xì)胞不被殺傷,人的NK細(xì)胞抑制性受體主要有殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell Ig-like receptors, KIR)和凝集素樣受體CD94/NKG2A,在調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能方面起重要作用。活化受體識別經(jīng)典、非經(jīng)典的MHC-I類分子或MHC-I類相關(guān)分子,在NK活化的啟動方面起關(guān)鍵作用,其中尤為引人注目的是NKG2D,NKG2D的配基為非經(jīng)典的MHC樣分子MICA (MHC class I chain-related protein A)、MICB及ULBP -1,2,3,4(UL16-binding protein-1,2,3,4),這些分子在許多上皮及非上皮來源的腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞和受到“應(yīng)激性刺激”的細(xì)胞均有表達(dá)或上調(diào)。研究表明,NKG2D的單獨活化即足以刺激NK細(xì)胞的活化,并能克服抑制性受體的強勢信號,因此,在NK細(xì)胞活化過程中起著舉足輕重的作用。而NKG2D配體的表達(dá)水平,可能決定著NKG2D的活化與否。目前,對MICA的結(jié)構(gòu)與功能,以及與疾病關(guān)系等方面的研究都取得重要進(jìn)展,但對其表達(dá)調(diào)控機制的研究卻很少。干擾素是機體抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要免疫調(diào)節(jié)劑。I型干擾素(IFN-α和IFN-β)具有抑制病毒復(fù)制、抑制細(xì)胞增殖、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。II型干擾素(IFN-γ),又稱免疫干擾素,是由Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的多功能性細(xì)胞因子,是重要的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑,能激活單核巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)多種細(xì)胞表達(dá)MHC I類和II類分子而增強抗原遞呈,促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1分化等。IFN-α是經(jīng)典的NK細(xì)胞活化劑,已廣泛用于多種實體瘤和病毒性肝炎的治療,但I(xiàn)FN-γ對腫瘤的臨床療效卻不盡如人意。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)IFN-α和IFN-γ對NK細(xì)胞受體的調(diào)節(jié)作用是相反的,IFN-α可上調(diào)活化性受體NKG2D表達(dá),下調(diào)抑制性受體NKG2A表達(dá),而IFN-γ的作用則恰恰相反。MICA和MICB5’側(cè)翼區(qū)均含有一段與熱休克蛋白70基因啟動子熱休克應(yīng)答元件相似的調(diào)控序列,基因在應(yīng)激條件下的誘導(dǎo)表達(dá)與該序列的活化有關(guān),上調(diào)MICA表達(dá)的應(yīng)激刺激亦能上調(diào)HSP70的表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn),IFN-α可上調(diào)HSP70的表達(dá),而IFN-γ下調(diào)HSP70表達(dá);IFN-α可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞表達(dá)MICA分子;金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)的剪切作用可削弱細(xì)胞膜表面MICA分子的表達(dá),而IFN-γ可增強MMPs的剪切功能。因此推測兩者可能對人腫瘤細(xì)胞NKG2D配體MICA分子的表達(dá)在多級水平存在相反的調(diào)節(jié)作用。 本研究中,我們首先觀察了IFN-α和IFN-γ對人宮頸癌細(xì)胞(HeLa和Caski)及血液系統(tǒng)腫瘤(K562和Raji)MICA表達(dá)的影響,并且觀察了MICA表達(dá)的變化對NK細(xì)胞識別與殺傷的影響,以期探討IFN-α和IFN-γ是否相反地調(diào)節(jié)了MICA的表達(dá),并影響了腫瘤細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷的敏感性。進(jìn)一步,我們構(gòu)建了pGL3/MICA-promoter螢光報告重組載體,觀察了IFN-α和IFN-γ是否通過調(diào)節(jié)MICA啟動子轉(zhuǎn)錄活性影響MICA的表達(dá)。同時,觀察了IFN-γ能否通過增強金屬基質(zhì)蛋白酶的剪切功能而使腫瘤細(xì)胞的膜結(jié)合型MICA脫落形成可溶性MICA。從而在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平兩方面探討MICA表達(dá)的調(diào)控機制。 方法 1.RT-PCR法檢測MICA mRNA的表達(dá) 2.免疫組化法鑒定MICA蛋白的表達(dá) 3.MTT法檢測人外周血NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷 4.MICA啟動子克隆載體的構(gòu)建: 酚氯仿法提取基因組DNA,PCR法擴增MICA啟動子序列,與pMD18-T連接,構(gòu)建MICA啟動子克隆載體,進(jìn)行DNA序列測定。 5. pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組載體的構(gòu)建:應(yīng)用限制性內(nèi)切酶將MICA啟動子序列從克隆載體上切下來,連接到螢光報告基因載體pGL3-basic上,構(gòu)建pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組載體。 6.MICA啟動子活性的檢測:以pLR-TK作為轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參照,分別與pGL3-basic、pGL3-control、pGL3/MICA-promoter質(zhì)粒通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中,參照雙螢光報告基因系統(tǒng)操作手冊(Promega),裂解細(xì)胞,synergy HT多功能酶標(biāo)儀檢測螢光素酶活性。 7. RT-PCR法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物的表達(dá)。 8. ELISA法檢測培養(yǎng)上清中可溶性MICA的含量。 結(jié)果 1.IFN-α和IFN-γ對腫瘤細(xì)胞MICA表達(dá)水平的不同影響RT-PCR結(jié)果顯示,人宮頸癌細(xì)胞Hela和人紅白血病細(xì)胞K562 MICA表達(dá)陽性,人宮頸癌細(xì)胞Caski為弱陽性,人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞Raji為陰性。IFN-α對MICA(+)和MICA(-)腫瘤細(xì)胞MICA mRNA的表達(dá)均有增強作用;而IFN-γ則抑制MICA(+)腫瘤細(xì)胞MICA mRNA的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示IFN-α和IFN-γ對腫瘤細(xì)胞表面MICA分子的蛋白表達(dá)水平具有相反的調(diào)節(jié)作用。 2.IFN-α和IFN-γ影響腫瘤細(xì)胞對外周血NK細(xì)胞殺傷的敏感性IFN-α1000u/ml可明顯上調(diào)MICA(+)和MICA(-)腫瘤細(xì)胞對外周血NK細(xì)胞殺傷的敏感性;IFN-γ1000u/ml則可下調(diào)MICA(+)腫瘤細(xì)胞對外周血NK細(xì)胞殺傷的敏感性�？贵w阻斷實驗顯示MICA表達(dá)水平的變化與NK細(xì)胞殺傷活性變化密切相關(guān)。 3.MICA啟動子序列的克隆提取新鮮培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞的基因組DNA,以MICA啟動子序列的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng),PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后,與pMD18-T載體連接、酶切鑒定后測序,證實已獲得的DNA為MICA啟動子序列,結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。 4.pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組載體的構(gòu)建用HindIII和XhoI從克隆載體pMD18-T/MICA-promoter切下MICA啟動子片段,與經(jīng)相同雙酶切的pGL3-basic質(zhì)粒進(jìn)行粘端連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109 ,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建好的pGL3/MICA-promoter螢光報告重組載體。 5.IFN-α和IFN-γ對MICA啟動子活性的影響用脂質(zhì)體將構(gòu)建好的pGL3/MICA-promoter螢光報告基因重組質(zhì)粒和作為轉(zhuǎn)染效率內(nèi)參照的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HeLa和Caski細(xì)胞中,分別以IFN-α和IFN-γ1000u/ml誘導(dǎo)48h,裂解細(xì)胞,雙螢光報告基因檢測系統(tǒng)檢測裂解產(chǎn)物中螢光素酶的活性。結(jié)果顯示,IFN-α1000 u/ml誘導(dǎo)48h可顯著提高M(jìn)ICA啟動子轉(zhuǎn)錄活性,但未觀察到IFN-γ對MICA啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。 6.IFN-α和IFN-γ對可溶性MICA分子釋放的影響RT-PCR結(jié)果顯示,IFN-γ上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶2(MT2-MMP)的表達(dá),并下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP-1)的表達(dá),但未發(fā)現(xiàn)IFN-α對兩者表達(dá)變化的影響。進(jìn)一步用ELISA檢測HeLa和K562細(xì)胞培養(yǎng)上清中可溶性MICA含量的變化,發(fā)現(xiàn)IFN-γ1000u/ml誘導(dǎo)48h可明顯提高上清中可溶性MICA的水平。 結(jié)論 1.IFN-α上調(diào)了腫瘤細(xì)胞中MICA mRNA和蛋白的表達(dá),繼而增強NK對其識別與殺傷。 2.IFN-γ下調(diào)了腫瘤細(xì)胞中MICA mRNA和蛋白的表達(dá),繼而降低NK對其識別與殺傷。 3. IFN-α通過增強MICA啟動子活性而從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)MICA基因的表達(dá)。 4.IFN-γ通過增強基質(zhì)金屬蛋白酶的剪切作用,降低了膜表面MICA的表達(dá)。 本研究首次提出了,IFN-α和IFN-γ對人腫瘤細(xì)胞NKG2D配體MICA分子的表達(dá)具有相反的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步探討了兩者對NKG2D受配體系統(tǒng)的影響的機制,為研究NK細(xì)胞殺傷機制和腫瘤免疫逃逸機制提供了依據(jù),為促使活化性和抑制性信號的平衡向活化方向傾斜,增強機體抗腫瘤能力提供了新的策略。
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【學(xué)位授予單位】：山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 田志剛,孫lm;NK細(xì)胞的免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1997年03期

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本文編號：2376634