【摘要】：目的:構(gòu)建人肌紅蛋白(Mb)原核表達載體并誘導(dǎo)其表達、純化及鑒定目的蛋白。pQE方法:根據(jù)已報道的人Mb基因序列,采用RT-PCR技術(shù)從人骨骼肌組織中獲得肌紅蛋白cDNA序列。將所得的PCR產(chǎn)物插入克隆載體pGEM-Teasy中,得重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定正確后,將酶切目的片段插入原核表達載體pQpQEE30中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)M15,通過IPTG誘導(dǎo)表達出帶有6個組氨酸的融合蛋白。經(jīng)鎳固定金屬親和層析純化。結(jié)果:序列分析表明,人Mb基因成熟肽編碼區(qū)含有465 bp,編碼153個氨基酸;與GenBank(NM203378)中已報道的Mb核苷酸序列有98.50%同源性。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析顯示,表達的融合蛋白占菌體蛋白總量的31%,相對分子質(zhì)量約為16700,并與商品化的人Mb單抗呈特異性反應(yīng)。經(jīng)Ni2+-NTA agarose純化獲得SDS-PAGE電泳下單一條帶。結(jié)論:在大腸桿菌中獲得了人Mb的高效表達。
[Abstract]:Objective: to construct the prokaryotic expression vector of human myoglobin (Mb) and induce its expression, purify and identify the target protein. PQE method: according to the reported human Mb gene sequence, The cDNA sequence of myoglobin was obtained from human skeletal muscle by RT-PCR technique. The recombinant plasmid was obtained by inserting the PCR product into the cloned vector pGEM-Teasy. After restriction endonuclease digestion, PCR and sequencing, the target fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pQpQEE30 and transformed into Escherichia coli (E.coli) M15. The fusion protein with 6 histidine was induced by IPTG. It was purified by nickel immobilized metal affinity chromatography. Results: sequence analysis showed that the mature peptide coding region of human Mb gene contained 465 bp, encoding 153 amino acids, and had 98.50% homology with Mb nucleotide sequence reported in GenBank (NM203378). IPTG induced expression, SDS-PAGE electrophoresis and Western blot analysis showed that the expressed fusion protein accounted for 31% of the total bacterial protein, and the relative molecular weight was about 16700, and the fusion protein reacted specifically with the commercial human Mb monoclonal antibody. SDS-PAGE electrophoresis was obtained by Ni2-NTA agarose purification. Conclusion: the high expression of human Mb was obtained in Escherichia coli.
【作者單位】： 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室 解放軍第461醫(yī)院檢驗科 吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室
【基金】：吉林省科技廳社會發(fā)展計劃項目資助課題(20030450) 吉林省科技廳重點項目資助課題(20030402) 2004年吉林大學(xué)創(chuàng)新基金資助課題 吉林省杰出青年基金資助課題(20050113)
【分類號】：R346

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本文編號：2375992