【摘要】： 先天性巨結(jié)腸癥(Hirschprung disease,HD)于1886年由丹麥醫(yī)生Harlald Hirschsprung首先描述。在先天性胃腸道畸形中HD發(fā)病率高居第二位,約占存活嬰兒的1/2000—1/5000。HD在胚胎4-12周時發(fā)生,主要原因是神經(jīng)節(jié)細胞不能在腸壁內(nèi)聚集定位。根據(jù)其病變腸段不同,HD可分為短段型、長段型、全結(jié)腸型以及全消化道型。其主要特征是遠段腸管神經(jīng)節(jié)細胞減少或缺如。巨結(jié)腸同源病(Allied Hirschsprung’s disorder,HAD)的臨床表現(xiàn)酷似HD,但其病理變化卻與HD明顯不同,其表現(xiàn)為:神經(jīng)節(jié)細胞減少癥(HYPG)神經(jīng)節(jié)細胞不成熟癥(IND)神經(jīng)節(jié)細胞異位癥巨大神經(jīng)節(jié)細胞癥。這類疾病既往常被忽視而錯誤地診斷為先天性巨結(jié)腸,而它的發(fā)病率可高達先天性巨結(jié)腸的20%-75%。 原癌基因Ret是由Talabashi等于1985年首先在髓樣甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)的,是一種在DNA重組活化過程中產(chǎn)生的原癌基因,有80 kb,21個外顯子,分為5個區(qū)。Ret原癌基因編碼產(chǎn)物Ret蛋白(酪氨酸激酶受體)是一種超家族跨膜蛋白,在神經(jīng)節(jié)細胞中有廣泛表達。Ret蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的機制是:該受體與細胞外因子結(jié)合形成二聚體導(dǎo)致其構(gòu)型發(fā)生變化,使得受體自身磷酸化,激活膜內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶,同時使底物的酪氨酸磷酸化,這樣信號進入到細胞內(nèi),再進一步傳遞給效應(yīng)子(effector)、傳遞子(transducer)或聯(lián)結(jié)子(adaptor),從而影響細胞的生理活動及生長發(fā)育。該基因發(fā)生突變會引起神經(jīng)嵴細胞遷移、分化的異常從而引發(fā)疾病。 神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)是NO合成的限速酶,而NO是抑制性非腎上腺素能非膽堿能(NANC)神經(jīng)的重要傳遞和調(diào)節(jié)遞質(zhì),這類遞質(zhì)對胃腸運動產(chǎn)生重要的調(diào)解作用。nNOS神經(jīng)元和神經(jīng)纖維直接產(chǎn)生NO擴散到平滑肌細胞內(nèi),激活鳥嘌呤環(huán)化酶(GC),增加cGMP的濃度,降低鈣離子濃度或降低肌細胞對鈣離子的敏感性,引起平滑肌松弛。另外,結(jié)腸壁環(huán)肌自主收縮反應(yīng)(機械慢波)部分由粘膜下起搏區(qū)引發(fā)的電生理活動控制,而粘膜下層部分由NO能神經(jīng)支配。因此nNOS表達異常也會引發(fā)相應(yīng)病變。 本實驗采用免疫組織化學(xué)方法,觀察HD、HAD及正常結(jié)腸組織中Ret、nNOS的表達情況,以探討Ret、nNOS在神經(jīng)發(fā)育上的作用意義。同時進一步了解HD、HAD兩者之間的聯(lián)系和區(qū)別。 實驗以臨床確診的HD和HAD病例為模型, 26例標(biāo)本均來自同濟醫(yī)院病理科術(shù)后病理診斷的存檔蠟塊。其中HD組15例,男12例,女3例;HAD組11例,男8例,女3例,年齡1個月到9歲,每例采集狹窄段,擴張段組織蠟塊各1塊,每蠟塊作連續(xù)切片3張,片厚6um。同時取正常組(即非HD和HAD的小兒外科標(biāo)本)10例作對照組,年齡3歲到8歲,取其結(jié)腸組織做石蠟切片。 一抗為單克隆抗體,采用鏈菌素親生物蛋白—過氧化物酶(SABC)免疫組化法,從兩個方面觀察二者的聯(lián)系和區(qū)別。第1部分比較3組不同部位Ret陽性細胞的表達狀況:免疫組化法后每組取五張切片,每張切片在20×10倍顯微鏡下隨機取五個視野,光鏡下記數(shù),對結(jié)果進行統(tǒng)計;第2部分重點觀察神經(jīng)遞質(zhì)(nNOS)的表達:對3組不同的部位各取5個視野,其圖像經(jīng)攝像儀輸入電子計算機,經(jīng)HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)細胞測量程序處理,去除背景灰度,對其棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物的積分光密度進行統(tǒng)計學(xué)分析。比較3組在nNOS表達上的差異,所得數(shù)據(jù)為臨床上HD和HAD的診斷提供客觀的依據(jù)。 實驗結(jié)果:①Ret蛋白在先天性巨結(jié)腸和巨結(jié)腸同源病的擴張段以及對照組均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(P0.05);在先天性巨結(jié)腸狹窄段大多數(shù)表現(xiàn)為陰性反應(yīng),極少數(shù)出現(xiàn)陽性反應(yīng);而巨結(jié)腸同源病狹窄段可見Ret免疫反應(yīng)蛋白陽性細胞,且偶見巨大的陽性細胞。先天性巨結(jié)腸狹窄段分別與巨結(jié)腸同源病狹窄段和對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。②nNOS在先天性巨結(jié)腸、巨結(jié)腸同源病的擴張段及對照組均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(P0.05);在先天性巨結(jié)腸狹窄段大多數(shù)表現(xiàn)為陰性反應(yīng),極少數(shù)出現(xiàn)陽性反應(yīng);而巨結(jié)腸同源病狹窄段可見為數(shù)不多的nNOS免疫反應(yīng)陽性細胞,且偶見含較多陽性細胞的巨大神經(jīng)叢。先天性巨結(jié)腸狹窄段分別與巨結(jié)腸同源病狹窄段和對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。 實驗結(jié)果提示HD和HAD的發(fā)病可能由不同的機制引起,其證據(jù)如下:①Ret蛋白在神經(jīng)嵴細胞的遷移、分化、發(fā)育上有重要作用,其表達異�？梢餒D的發(fā)病;但Ret蛋白與HAD的關(guān)系不密切,而且基因?qū)W上也多次證明HAD與Ret基因的突變無關(guān)。②HD的發(fā)病和nNOS的表達減少密切相關(guān);而HAD的發(fā)病可能與ENS發(fā)育過程中不良環(huán)境刺激引起的神經(jīng)遞質(zhì)表達紊亂有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2371400