【摘要】： 葉酸在生物生長和發(fā)育過程中扮演重要的角色，它參與生物體內(nèi)許多重要反應(yīng)和重要物質(zhì)的合成。人群中葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致胎兒許多先天性異常的發(fā)生率上升，(如先天性心臟病、神經(jīng)管發(fā)育異常等)。目前許多模式生物應(yīng)用于葉酸缺乏導(dǎo)致先天性發(fā)育異常的研究，在這些模式生物中同樣發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏可導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。但目前葉酸缺乏導(dǎo)致先天性發(fā)育異常的機(jī)制仍不明確。 1．葉酸缺乏斑馬魚模型的建立 本實(shí)驗(yàn)利用DHFR拮抗劑MTX和將DHFR基因knock-down的方法構(gòu)建葉酸缺乏的兩種斑馬魚模型。在我們采用化學(xué)遺傳學(xué)的方法即用葉酸拮抗劑MTX構(gòu)建葉酸缺乏斑馬魚模型的實(shí)驗(yàn)中，我們探尋了MTX影響斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的特定濃度和特異性時(shí)段，并就MTX拮抗葉酸的機(jī)理進(jìn)行了證實(shí)。我們還采用基因knock-down的方法，通過顯微注射嗎啡啉修飾的反義RNA來knock-down DHFR基因，阻斷葉酸生物學(xué)活性的發(fā)揮從而構(gòu)建另一類葉酸缺乏斑馬魚模型。在實(shí)驗(yàn)中我們通過上述兩種方法構(gòu)建的葉酸缺乏斑馬魚模型的心血管系統(tǒng)發(fā)育異常有相似性，都表現(xiàn)為心臟發(fā)育異常表型多樣、心功能受損、心臟流出道發(fā)育異常和血管發(fā)育受到干擾。斑馬魚葉酸缺乏模型的成功建立有助于我們進(jìn)行后續(xù)葉酸缺乏導(dǎo)致先天性發(fā)育異常機(jī)理的研究。 2．葉酸缺乏對(duì)心血管發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 在第一部分構(gòu)建的葉酸缺乏斑馬魚模型的基礎(chǔ)上，我們?cè)诖瞬糠謱?shí)驗(yàn)中通過原位雜交或Q—PCR的方法檢測(cè)了葉酸缺乏對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因vmhc，amhc，hand2，mef2a，mef2c，bmp2b，nkx2.5，has2，以及對(duì)血管發(fā)育相關(guān)基因flk-1,ephrinB2和ephB4表達(dá)的影響。并就hand2，mef2c，bmp2b，nkx2.5和has2之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行了初步探討，以助于了解葉酸缺乏導(dǎo)致此五個(gè)基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)理。我們還初步探討了葉酸缺乏對(duì)Hedgehog信號(hào)通路和Nodal信號(hào)通路的影響。 (1)葉酸缺乏后部分心血管發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)減弱 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸缺乏對(duì)心臟發(fā)育相關(guān)基因vmhc，amhc和mef2a的表達(dá)無影響，葉酸缺乏導(dǎo)致心臟發(fā)育相關(guān)基因hand2，mef2c，bmp2b，nkx2.5和has2的表達(dá)減弱；葉酸缺乏對(duì)血管發(fā)育相關(guān)基因ephB4的表達(dá)無明顯影響，葉酸缺乏導(dǎo)致血管發(fā)育相關(guān)基因flk-1和ephrinB2的表達(dá)減弱。上述這些心血管發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)減弱可能是葉酸缺乏導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)理。 (2)hand2與mef2c、bmp2b、nkx2.5和has2相互作用的初步研究 在此部分實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)hand2、mef2c、bmp2b、has2和nkx2.5之間存在著復(fù)雜的相互作用，在斑馬魚心臟發(fā)育過程中，mef2c和bmp2b對(duì)hand2的表達(dá)有一定的調(diào)控作用，hand2可影響nkx2.5和has2的表達(dá)。葉酸缺乏可能影響了這些基因之間復(fù)雜的相互調(diào)控作用而導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。 (3)在斑馬魚心臟發(fā)育過程中dhfr與hand2相互作用的研究 在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在斑馬魚心臟發(fā)育過程中dhfr可調(diào)控hand2的表達(dá)。dhfr knock-down后hand2的表達(dá)下調(diào)，是dhfr knock-down導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)理。hand2過表達(dá)可挽救dhfr knock-down導(dǎo)致的心臟發(fā)育異常表型，從而為葉酸缺乏導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的基因治療提供線索。 3．葉酸缺乏對(duì)Hedgehog和Nodal信號(hào)通路的影響 在此部分實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了葉酸缺乏對(duì)Hedgehog信號(hào)通路下游因子foxa2和ptc1以及對(duì)Nodal信號(hào)通路下游因子ntl和gsc表達(dá)的影響，以探尋葉酸缺乏導(dǎo)致心臟發(fā)育異常和右側(cè)異位的可能機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸缺乏影響了Hedgehog信號(hào)通路的功能，，但對(duì)Nodal信號(hào)通路影響不明顯。葉酸缺乏導(dǎo)致軸中胚層發(fā)育紊亂。 4．葉酸缺乏導(dǎo)致斑馬魚胚胎凋亡過度 葉酸缺乏不僅只影響基因表達(dá)的水平，還可導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，造成細(xì)胞凋亡過度。在此部分實(shí)驗(yàn)中，我們從檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平即DNA斷裂方面入手對(duì)葉酸缺乏導(dǎo)致心臟發(fā)育異常的機(jī)理進(jìn)行初步探討的結(jié)果表明，葉酸缺乏可以導(dǎo)致細(xì)胞DNA斷裂增加而促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2370897