【摘要】：卵透明帶(zona pellucida，ZP)，是哺乳動物卵子外包裹的一層半透明的糖蛋白基質，是精子與卵細胞識別和結合的部位，同時對卵子起保護作用。卵透明帶的生理特性極具研究價值，，ZP蛋白的特性使之具有開發(fā)成避孕疫苗的潛力，然而，ZP是極具組織特異性的蛋白，天然存在量很少。為了得到大量高純度的ZP3蛋白進行深入的抗生育疫苗和免疫不孕診斷的研究，我們重組表達了人ZP3成熟肽片段。 本研究克隆了hZP3成熟肽(第23～383位氨基酸序列)的基因片段，運用基因工程方法將其重組到穿梭型載體質粒pPICZaA上，選擇測序正確的重組質粒，在大腸桿菌中擴增質粒、Sac Ⅰ線性化后使用電擊轉化的方法把重組基因轉入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，用高濃度的Zoecin篩選到整合了高拷貝重組基因的酵母菌株，通過SDS-PAGE和Western Blotting方法鑒定甲醇誘導表達的重組蛋白，借助發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵表達rhZP3，目的蛋白利用載體質粒上設計的6個組氨酸純化標記，以Ni~(2+)螯合柱親和層析法純化，純化后的rhZP3使用胞壁酰二肽(Muramyldipeptide，MDP)佐劑免疫靈長類動物食蟹猴(Macaca fascicularis)，以豬ZP3包被抗原用ELISA檢測抗血清，并用小鼠卵巢冰凍切片與人卵巢石蠟切片進行免疫組化鑒定，用猴抗rhZP3抗血清進行體外抗小鼠精卵結合實驗以評價抗血清的抑制受精能力。 結果表明，在載體質粒中成功克隆了hZP3成熟肽的cDNA序列，用重組質粒轉化并篩選得到可以穩(wěn)定表達rhZP3的重組酵母，Western Blotting鑒定重組蛋白具有免疫學活性，通過發(fā)酵罐高密度表達后純化得到高純度的rhZP3，以之免疫食蟹猴，獲得了較高滴度的抗hZP3抗體，抗體與豬ZP3有交叉反應性，猴抗rhZP3抗血清可以與小鼠和人卵母細胞上的透明帶發(fā)生免疫反應，并在體外明顯能抑制小鼠卵子結合精子。 研究結果說明，重組hZP3的確可以在酵母中分泌表達，并具有與天然蛋白相似的活性；抗rhZP3抗血清在體外體現(xiàn)了封閉透明帶、阻斷受精的活性。重組蛋白可以滿足開發(fā)抗生育疫苗和免疫不孕診斷的需求。
[Abstract]:The pellucida zone (zona pellucida,ZP) is a translucent glycoprotein matrix encapsulated in mammalian eggs. It is the site of sperm recognition and binding with egg cells and plays a protective role on eggs. The physiological characteristics of the pellucida zone are of great value, and the ZP protein has the potential to be developed into a contraceptive vaccine. However, ZP is a highly tissue-specific protein, which is naturally present in a small amount. In order to obtain a large amount of high purity ZP3 protein for further study of antifertility vaccine and immunological infertility diagnosis, we expressed a mature peptide fragment of human ZP3. In this study, we cloned the gene fragment of mature peptide of hZP3 (23 ~ 383 amino acid sequence), recombined it into shuttle vector plasmid pPICZaA by genetic engineering method, selected the correct sequencing recombinant plasmid, and amplified the plasmid in Escherichia coli. The recombinant gene was transformed into Pichia pastoris (Pichia pastoris), by electroporation after linearization of Sac 鈪

本文編號：2368646