【摘要】：Annexin B2(Anx B2)和Annexin B2(Anx B3)是新克隆出的兩個非脊椎動物的膜聯(lián)蛋白家族新成員。它的結構、功能和進化的分析研究,對與全面了解膜聯(lián)蛋白家族的生物學功能以及進化具有重要意義。膜聯(lián)蛋白家族是一類鈣磷脂結合蛋白超家族,存在于大多數(shù)真核生物細胞內,有著十分廣泛且重要的生理功能,如參與細胞骨架運動、調節(jié)細胞生長、形成膜離子通道、參與細胞信號轉導等。這類蛋白結構上具有明顯特征:C端保守區(qū)大多由α螺旋組成,其中含有主要的Ca~(2+)磷脂結合活性位點;N端為可變區(qū),不同家族成員N端序列組成及長度各不相同。 Anx B2和Anx B3是我們用簡并引物-PCR方法從豬囊尾蚴中克隆得到的新基因。將其核酸和氨基酸序列進行同源比較和分析,確認它們是兩個新的Annexin家族成員。作為扁形動物門發(fā)現(xiàn)的Annexin家族成員,研究Anx B2和Anx B3不僅可以了解其對豬囊尾蚴寄生、移行、生長、發(fā)育等生命活動的重要意義,為預防和治療該類疾病提供新的途徑,而且可以為整個Annexin家族的研究提供有意義的遺傳及分子進化學資料。因此我們構建了Anx B2和Anx B3的融合表達載體,在大腸桿菌中實現(xiàn)了高表達,利用親和層析及離子交換層析技術純化蛋白;采用計算機同源模建、缺失體的構建研究Anx B2和Anx B3結構與功能的關系;并對它們的抗原性和抗凝血功能等方法研究了Anx B2和Anx B3的主要生物學活性。同時與Anx B1(1997年由本教研室發(fā)現(xiàn))的部分功能進行比較。 本研究主要結果如下: 1.用簡并引物 -PCR方法從囊尾蚴中克隆出Anx B2和Anx B3兩個新基因,Anx B2和Anx B3的cDNA分別含有1065和910 bp開放閱讀框,編碼355、310個氨基酸,計算分子量為38682.05和35874.19 Dalton。 2.通過Blast同源性檢索,表明Anx B2和Anx B3與Annexin家族成員高度同源;它具有4個典型的Annexin重復保守結構域:二級結構預測Anx B2和Anx B3均以α螺旋為主,無明顯跨膜區(qū),無信號肽,提示其為胞漿蛋白,這些與Annexin特征相符。將Anx B2和Anx B3編碼序列克隆至原核表達載體pGEX-5T,親和層析純化后得到其融合蛋白。經(jīng)N端測序證明與預測序列完全一致。根據(jù)以上的結構特點表明Anx B2和Anx B3屬于Annexin家族,又由于它們N端與現(xiàn)有Annexin家族成
[Abstract]:Annexin B2 (Anx B2) and Annexin B2 (Anx B3) are two newly cloned members of the annexin family of non-vertebrate animals. The analysis and study of its structure, function and evolution are of great significance in understanding the biological function and evolution of integrin family. As a kind of calcium phospholipid binding protein superfamily, the membrane binding protein family exists in most eukaryotic cells and has a wide range of important physiological functions, such as participating in the cytoskeleton movement, regulating cell growth and forming membrane ion channels. Participate in cell signal transduction. The conserved region of C terminal is composed of 偽 helix, which contains the main Ca~ (2) phospholipid binding activity site, and the N terminal is variable region, and the N-terminal sequence composition and length of different family members are different. Anx B2 and Anx B 3 were cloned from cysticercus cellulosae by degenerate primer PCR method. The nucleic acid and amino acid sequences were compared and analyzed, and they were identified as two new Annexin family members. As a member of the Annexin family found in the phylum oblate, the study of Anx B2 and Anx B3 can not only understand the importance of Anx B2 and Anx B3 in the parasitism, migration, growth and development of cysticercus cellulosae, but also provide a new way for the prevention and treatment of these diseases. And it can provide significant genetic and molecular chemical data for the study of the whole Annexin family. Therefore, we constructed the fusion expression vector of Anx B2 and Anx B3, and achieved high expression in Escherichia coli. The protein was purified by affinity chromatography and ion exchange chromatography. The relationship between the structure and function of Anx B2 and Anx B 3 was studied by computer homologous modeling and deletion, and the main biological activities of Anx B2 and Anx B 3 were studied by means of their antigenicity and anticoagulant function. At the same time, it is compared with some functions of Anx B1 (discovered by our teaching and research department in 1997). The main results of this study are as follows: 1. Two new genes, Anx B2 and Anx B3, were cloned from cysticercaria by degenerate primer PCR method. The cDNA of Anx B2 and Anx B3 contained 1065 and 910 bp open reading frames, respectively, encoding 355310 amino acids. The calculated molecular weights were 38682.05 and 35874.19 Dalton., respectively. 2. Blast homology search showed that Anx B2 and Anx B3 were highly homologous to Annexin family members. It has four typical Annexin repeat conserved domains: the secondary structure predicts that both Anx B2 and Anx B 3 are 偽 helix, with no obvious transmembrane region and no signal peptide, indicating that they are cytoplasmic proteins, which are consistent with the characteristics of Annexin. The encoding sequences of Anx B2 and Anx B 3 were cloned into prokaryotic expression vector pGEX-5T, affinity chromatography to obtain the fusion protein. It was proved by N-terminal sequencing that the predicted sequence was in good agreement with the predicted sequence. According to the structural characteristics above, Anx B2 and Anx B3 belong to the Annexin family, and because of their N-terminal, they form the existing Annexin family.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：Q51

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本文編號：2363032