【摘要】：研 究 目 的 : 通 過 細(xì) 胞 工 程 的 方 法 制 備 重 組 幽 門 螺 桿 菌(Helicobacter pylori,H.pylori)細(xì)胞空泡毒素抗原(vacuolating cytotoxin antigen,VacA)的單克隆抗體(簡稱單抗),并初步研究其應(yīng)用。為制備檢測 VacA 的試劑盒及探討 VacA 的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法:本實驗分兩部分進(jìn)行 一 、重組 VacA 的表達(dá)與純化:在已構(gòu)建的基因工程(pQE30-V-DH5α)基礎(chǔ)上,大量誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白 VacA。用 SDS-PAGE 分析表達(dá)形式,Western blot 鑒定其抗原性, Ni2+-NTA 樹脂純化表達(dá)蛋白,SDS-PAGE 鑒定其純度,Bradford 法測定蛋白濃度。用重組蛋白建立檢測小鼠 VacA 抗體的間接 ELISA,評價重組蛋白免疫原性。 二、 VacA 單克隆抗體的制備和初步應(yīng)用:1.以純化所得 VacA 為抗原免疫 BALB/c 小鼠,40 天后間接 ELISA 測小鼠尾靜脈血以檢測有無抗體產(chǎn)生;2.將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞用 50%聚乙二醇(PEG)融合,HAT 培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇出融合細(xì)胞,用建立的間接 ELISA 法篩選分泌VacA 抗體的細(xì)胞;3. 有限稀釋法克隆化培養(yǎng),間接 ELISA 法檢測能穩(wěn)定分泌抗 VacA 抗體的陽性細(xì)胞株,b.v 公司的抗體亞型檢測試劑盒測定抗體類別;4.用間接 ELISA 法測定體外傳代培養(yǎng)的 zhD4 細(xì)胞株分泌抗體的穩(wěn)定性;5. 大量制備 zhD4 細(xì)胞株小鼠腹水后,飽和硫酸銨沉淀法初步純化,間接 ELISA 法測定其效價,Bradford 法測定蛋白含量;6.用制備的單克隆抗體建立初步應(yīng)用于胃粘膜中 VacA 的檢測。
[Abstract]:Study on: preparation of vacuolating toxin antigen (vacuolating cytotoxin antigen, of Helicobacter pylori,H.pylori cells by the method of trapping through the process of fine cellularization in the preparation of the heavy group of Bacillus hirsurea (Helicobacter pylori,H.pylori) cell vacuolating toxin antigen (vacuolating cytotoxin antigen,) The monoclonal antibody (McAb) of VacA and its application were studied. To prepare the kit for detecting VacA and to explore the pathogenesis of VacA. Methods: this experiment was divided into two parts: the expression and purification of recombinant VacA: based on the constructed gene engineering (pQE30-V-DH5 偽), the recombinant protein VacA. was induced to express in large quantities. Its antigenicity was identified by, Western blot, Ni2-NTA resin was used to purify the expressed protein, the purity was identified by SDS-PAGE, and the protein concentration was determined by Bradford method. The immunogenicity of the recombinant protein was evaluated by indirect ELISA, using recombinant protein to detect mouse VacA antibody. 2. Preparation and preliminary application of VacA monoclonal antibody: 1. The purified VacA was used as antigen to immunize BALB/c mice. After 40 days, indirect ELISA was used to detect the production of antibodies in the tail vein of mice. Spleen cells and myeloma cells were fused with 50% polyethylene glycol (PEG). The fusion cells were selected in HAT medium. The cells secreting VacA antibody were screened by indirect ELISA method. 3. The indirect ELISA assay was used to detect the positive cell lines secreting anti-VacA antibody stably, and the antibody subtype detection kit of B. v company was used to detect the antibody types. 4. Indirect ELISA assay was used to determine the stability of secreted antibodies of zhD4 cell lines cultured in vitro. After the zhD4 cell line ascites were prepared in large quantities, saturated ammonium sulfate precipitation method was used to purify the mouse ascites, indirect ELISA method was used to determine its titer, and Bradford method was used to determine the protein content. 6. The monoclonal antibody was used for the detection of VacA in gastric mucosa.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2345068