【摘要】： 煙曲霉菌是存在于空氣中常見的腐生絲狀真菌病原體,其傳播方式為向空氣中釋放分生孢子,分生孢子為灰綠色,直徑僅為2-3μМ,極易進(jìn)入肺泡,據(jù)估計(jì)每人每天吸入幾百的煙曲霉菌分生孢子。其致病性依賴于宿主的免疫狀態(tài),在免疫活性個(gè)體中,由于宿主的免疫系統(tǒng)可以將其滅活而很少引起疾病,然而,當(dāng)它感染免疫缺陷病人時(shí),如器官移植術(shù)后,白血病,HIV感染等,可引起侵襲性煙曲霉菌病(Invasive Aspergillosis, IA),死亡率高達(dá)85%。在過去的十年里,隨著免疫受損病人的增加和免疫抑制治療的廣泛使用,并由于該感染診斷的困難和缺乏高效低毒的抗真菌治療措施,侵襲性煙曲霉菌病的發(fā)病率甚至已經(jīng)超過了最常見的真菌感染—侵襲性念珠菌病,而成為主要的機(jī)會(huì)病原性真菌。 煙曲霉菌基因組序列測(cè)序已經(jīng)完成,功能基因組學(xué)方法可以利用這些信息識(shí)別所有潛在的藥物作用靶位,這就要通過對(duì)這些病原性菌株進(jìn)行基因?qū)W操作,識(shí)別毒力因子,分析表型變化。識(shí)別煙曲霉菌生命必需基因是發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物的第一步。分子生物學(xué)的高速發(fā)展為病原微生物功能基因研究提供了豐富的技術(shù),如體內(nèi)表達(dá)技術(shù)(in vivo expression technology, IVET)、差異熒光誘導(dǎo)(differential fluorescence induction, DFI)等正向篩選鑒定方法,轉(zhuǎn)座子Tn5介導(dǎo)的逆向遺傳突變(transpoton Tn5-based reverse genetic mutation)和信號(hào)標(biāo)簽突變(Signature-tagged mutagenesis,STM)等反向鑒定技術(shù),另外,還有差減雜交、差異顯示等方法。目前已有多種技術(shù)用于了解煙曲霉菌基因功能。雖然利用這些技術(shù)在煙曲霉菌功能基因,包括毒力相關(guān)基因的篩選上取得了一些有價(jià)值的研究成果,但是,充分發(fā)掘和利用全基因組信息無疑將會(huì)大大加深該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。 雙鏈RNA介導(dǎo)的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程稱為RNA干涉(RNA interference , RNAi)。RNAi是指在多種生物細(xì)胞內(nèi),由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導(dǎo)同源序列mRNA的特異性降解,而導(dǎo)致的基因沉默(gene silencing)現(xiàn)象。因RNAi所導(dǎo)致的基因沉默發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,所以被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。RNAi具有特異性和高效性特點(diǎn),它作為新興的基因阻斷技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于基因功能及基因治療的相關(guān)研究。Liu等人在新型隱球菌中應(yīng)用RNAi技術(shù),構(gòu)建以pACT為啟動(dòng)子,靶基因正反雙向序列被250bpGFP序列隔開的發(fā)夾結(jié)構(gòu)載體,沉默靶基因,掀開了在真菌研究中應(yīng)用RNAi技術(shù)的新篇章。研究者在真菌粗糙鏈孢霉中識(shí)別了三個(gè)基因具有RNAi沉默分子機(jī)制:一是QDE1,它與在西紅柿中發(fā)現(xiàn)的RNA依賴的RNA聚合酶相似;二是QDE2與RDE1同源,RDE1是秀麗線蟲中雙鏈的DNA干涉所必需的;三是QDE3,它是RecQ DNA解螺旋酶家族的成員。煙曲霉菌數(shù)據(jù)庫(kù)http://tigrblast.tigr.org\ufmg\中可查到與它們同源的蛋白, blast score分別是6×10-122,2×10-65,3×10-154,由此可見,煙曲霉菌中可能存在RNAi機(jī)制, RNAi可用于研究煙曲霉菌基因功能。 本研究應(yīng)用dsRNA介導(dǎo)RNAi特異性沉默煙曲霉菌色素形成相關(guān)基因arp1,初步探討了RNAi在煙曲霉菌基因功能研究中的應(yīng)用;并且,運(yùn)用該方法研究煙曲霉菌生命必需基因nudC,進(jìn)一步證實(shí)了nudC基因?yàn)闊熐咕匦杌颉?第一部分dsRNA介導(dǎo)的RNAi沉默煙曲霉菌色素形成相關(guān)基因arp1的研究: arp1基因編碼一種脫水酶,該酶在灰綠色真菌的二羥基萘黑色素形成路徑中發(fā)揮作用,沉默arp1基因產(chǎn)生灰白色的分生孢子,其可有助于人補(bǔ)體C3在分生孢子上的沉積,而有力于吞噬細(xì)胞吞噬吸入人體的分生孢子。采用液氮研磨煙曲霉菌,提取總RNA,用含T7啟動(dòng)子序列的特異引物進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增出兩端含T7啟動(dòng)子序列的arp1基因。為了計(jì)算轉(zhuǎn)化率,合成了5’-FAM標(biāo)記的siRNA并用其電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌。以測(cè)序正確的兩端含T7啟動(dòng)子序列的arp1基因片段為模版使用MEGAscript RNAi Kit體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA,用合成的dsRNA電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌后,觀察煙曲霉菌表型變化,RT-PCR分析mRNA變化。結(jié)果:5’-FAM標(biāo)記的siRNA-arp1電穿孔轉(zhuǎn)化煙區(qū)霉菌12h后,經(jīng)熒光倒置顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示,每次成功轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到50%～55%;以dsRNA電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌后,轉(zhuǎn)化菌的arp1基因mRNA水平降低,轉(zhuǎn)化菌,陰性對(duì)照(mock和無關(guān)dsRNA對(duì)照)與18srRNA的比值分別為0.58±0.07;1.10±0.05;1.05±0.10,有顯著性差異(P0.05);并且,轉(zhuǎn)化菌產(chǎn)生與母代綠色菌株不同的灰色菌株,類似基因敲除的表型。 第二部分dsRNA介導(dǎo)的RNAi沉默煙曲霉菌nudC基因的研究: nudC基因在構(gòu)巢曲霉中是生命必需基因,它參與多種細(xì)胞功能如核移位,細(xì)胞壁沉積。采用同研究arp1基因相同的方法擴(kuò)增nudC基因,以序列正確的線性nudC基因片段為模版,使用MEGAscript? RNAi Kit體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA,用合成的dsRNA電轉(zhuǎn)化煙曲霉菌后,觀察煙曲霉菌表型變化,RT-PCR分析mRNA變化。結(jié)果:轉(zhuǎn)化后,可見轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)受到明顯抑制,而陰性對(duì)照菌株生長(zhǎng)正常。相差顯微鏡下可見陰性對(duì)照菌絲萌芽生長(zhǎng),而轉(zhuǎn)化菌孢子腫脹,菌絲生長(zhǎng)抑制;轉(zhuǎn)化菌的nudC基因mRNA水平降低,與18srRNA的比值為0.50±0.07,顯著低于mock和無關(guān)dsRNA對(duì)照與18srRNA的比值,1.09±0.06,1.10±0.09(F=9.38,P0.05)。 總之,煙曲霉菌色素形成相關(guān)基因arp1和煙曲霉菌nudC基因均為煙曲霉菌毒力相關(guān)基因。本研究用體外轉(zhuǎn)錄制備dsRNA介導(dǎo)RNAi特異性沉默靶基因,產(chǎn)生類似基因敲除的表型,證實(shí)RNAi是絲狀真菌中特異性下調(diào)基因表達(dá)及研究基因功能的有力工具。本研究為研究煙曲霉菌靶基因功能,識(shí)別和篩選煙曲霉菌生命必需基因,尋找新的藥物干預(yù)靶位,研制新型抗煙曲霉菌藥物奠定了基礎(chǔ),具有潛在的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R346

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