【摘要】： 一、研究目的 (1)研究不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞定位與端粒酶表達(dá)特征,探討這些特征對燒傷創(chuàng)面修復(fù)的臨床意義。 (2)研究人表皮干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定方法,比較在體外培養(yǎng)條件下不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)差異,為表皮干細(xì)胞在皮膚組織工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 二、研究方法 第一部分表皮干細(xì)胞的定位與端粒酶表達(dá)檢測 取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的胎兒皮膚和少兒、成年人燒傷整形植皮手術(shù)剩余皮片標(biāo)本,取材后立即用10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,4℃保存待測。所有標(biāo)本經(jīng)系列切片后,分別采用鼠抗人整合素β1(integrinβ1)、角蛋白19 (keratin19,K19)、p63轉(zhuǎn)錄因子(p63 transcription factor)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(telomerase reverse transcriptase catalytic subunit,TERT)單克隆抗體作為一抗,以免疫組織化學(xué)EnVision法檢測皮膚組織中表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素β1、角蛋白19、p63轉(zhuǎn)錄因子和TERT的表達(dá),200倍光鏡下觀察免疫組化結(jié)果,測定陽性表達(dá)率。 第二部分表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及端粒酶活性表達(dá)檢測 取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的胎兒皮膚,用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮,用Ⅳ型膠原快速粘附法分離、純化人表皮干細(xì)胞,以含表皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液等組成的人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。通過計算其克隆形成率、細(xì)胞周期測定及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法β1整合素、K19、p63單抗檢測等對培養(yǎng)細(xì)胞進行鑒定。均以角質(zhì)細(xì)胞作對照。以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和圖像分析法檢測體外培養(yǎng)的胎兒皮膚、少兒皮膚和成年人皮膚表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)。 三、研究結(jié)果 第一部分 胎兒皮膚、少兒皮膚和成年人皮膚表皮的基底部、毛囊周圍細(xì)胞均可見β1整合素、K19、p63和TERT呈棕黃色陽性表達(dá)。胎兒表皮基底層細(xì)胞β1整合素、K19和p63均為強陽性;少兒表皮基底層細(xì)胞中大部分細(xì)胞表達(dá)β1整合素、K19和p63陽性細(xì)胞均勻分布;成年人表皮基底層β1整合素、K19和p63弱陽性表達(dá),陽性細(xì)胞散在分布,且呈相對集中片狀分布,陽性細(xì)胞表達(dá)強度較胎兒組、少兒組低。 胎兒皮膚、少兒皮膚和成人皮膚端粒酶免疫組化染色均呈陽性,陽性細(xì)胞主要集中于表皮基底層。其中,胎兒表皮基底層陽性細(xì)胞表達(dá)強度較少兒表皮和成人表皮強,少兒次之,成人表皮表達(dá)最弱。 胎兒皮膚、少兒皮膚與成年人皮膚β1整合素、K19、p63和TERT陽性表達(dá)率均隨年齡增加而呈下降趨勢,組間差異有非常顯著性意義(P0.01)。 第二部分 分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞呈明顯克隆性生長,其克隆形成率明顯高于對照組,組間差異有顯著性意義(P0.05)。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn),人表皮干細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于角質(zhì)細(xì)胞組,組間差異有顯著性意義(P0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示,分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞β1整合素、K19和p63呈陽性表達(dá),角質(zhì)細(xì)胞對照組表達(dá)陰性。 分離培養(yǎng)的人胎兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、少兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、成人皮膚來源表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)均呈陽性。但表達(dá)強度不同,其表達(dá)強弱依次人胎兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、少兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、成人皮膚來源表皮干細(xì)胞。圖像分析法檢測各組細(xì)胞平均吸光度值和陽性面積值,結(jié)果顯示:胎兒組、少兒組、成人組表皮干細(xì)胞平均吸光度值和陽性面積值均隨年齡增加而逐漸降低,組間差異有顯著性意義(P 0. 05)。 四、研究結(jié)論 (1)胎兒皮膚、少兒皮膚和成人皮膚表皮干細(xì)胞主要位于表皮基底層,端粒酶表達(dá)陽性區(qū)域及信號強度與表皮干細(xì)胞的定位分布及陽性表達(dá)強度相一致。提示表皮干細(xì)胞的數(shù)量、端粒酶活性表達(dá)的強弱可能與不同發(fā)育階段皮膚組織的修復(fù)能力差異密切相關(guān)。 (2)本實驗采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮、用Ⅳ型膠原快速粘附法分離培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞,細(xì)胞呈明顯克隆性生長,G0/G1期細(xì)胞比例高,β1整合素、K19和p63免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性表達(dá)。表明在本實驗培養(yǎng)條件下分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞具有干細(xì)胞的生物學(xué)特性。 (3)體外培養(yǎng)的人胎兒期、少兒期、成人期表皮干細(xì)胞均有端粒酶活性表達(dá),其表達(dá)強弱依次為人胎兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、少兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、成人皮膚來源表皮干細(xì)胞。提示誘導(dǎo)和增強端粒酶活性表達(dá)對維持表皮干細(xì)胞在體外的自我更新和增殖能力可能具有重要意義。
[Abstract]:I. Purpose of the study (1) To study the localization of human epidermal stem cells and the expression of telomerase in different developmental stages, and to study the features of these characteristics on the burn wound. The clinical significance of the repair was as follows: (2) In vitro isolation culture and identification of human epidermal stem cells, the expression of telomerase activity of human epidermal stem cells in different developmental stages was compared under the condition of in vitro culture. in that skin the application of the invention lays the foundation for the application, The localization of the first part of the epidermal stem cells and the detection of the telomerase expression in the first part of the method were used to detect the fetal skin caused by the accidental abortion due to trauma, etc. and children and adult burn and shape skin-grafting hands The remaining skin pieces were fixed with 10% neutral buffered formalin, and the normal paraffin was embedded and stored at 4 鈩，

本文編號：2333965