【摘要】： 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)是目前所知的體內(nèi)功能最強的專職抗原遞呈細(xì)胞。通過MHC I類內(nèi)源性抗原遞呈途徑,它不僅能夠遞呈病毒抗原,有效活化初始性CD8+T細(xì)胞,啟動抗病毒免疫,同時此過程也是機體誘導(dǎo)自身抗原外周及中樞耐受的重要機制。 關(guān)于內(nèi)源性抗原遞呈途徑的研究數(shù)據(jù)大多來源于B細(xì)胞,目前認(rèn)為內(nèi)源性表達蛋白在胞漿生成后,可被蛋白酶體消化降解成8-10個氨基酸的多肽,經(jīng)抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運體(TAP)轉(zhuǎn)運進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER),在眾多分子伴侶如鈣聯(lián)蛋白(calnexin)、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin)、tapasin等的幫助下,與新生成的MHC I類分子形成穩(wěn)定復(fù)合物,通過高爾基體轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜,遞呈給CD8+T細(xì)胞。此過程可視為一個連續(xù)囊泡轉(zhuǎn)運過程,而關(guān)于此過程涉及的囊泡轉(zhuǎn)運機制,我們現(xiàn)在還所知甚少。 細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)運過程包括:囊泡的形成,囊泡的移動,囊泡與靶膜的拴縛(tethering)。近來細(xì)胞生物學(xué)研究表明,此生物學(xué)過程受到Rab蛋白家族及其效應(yīng)分子的調(diào)節(jié),并且不同Rab蛋白高度局限性地定位在各種囊泡的膜表面,故可被用于描述特定的內(nèi)吞體系和特定的轉(zhuǎn)運途徑。例如:Rab4可作為早期內(nèi)吞體的標(biāo)志,Rab5調(diào)節(jié)籠形蛋白(clathrin)衣被小泡在質(zhì)膜和早期內(nèi)吞體間的轉(zhuǎn)運,Rab7則與晚期內(nèi)吞體的形成、轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。因此,Rab分子可以作為“路標(biāo)”來描述抗原呈遞途徑中的復(fù)雜轉(zhuǎn)運過程。同時,國外及我室相關(guān)實驗提示某些Rab蛋白與抗原遞呈相關(guān),故進一步鑒定與DC內(nèi)源抗原遞呈囊泡轉(zhuǎn)運相關(guān)的Rab蛋白,研究這些Rab蛋白與DC內(nèi)源抗原遞呈的相關(guān)性具有重要意義,可為理解DC內(nèi)源抗原遞呈的分子調(diào)節(jié)機制奠定基礎(chǔ)。 近年大規(guī)模siRNA干擾技術(shù)的進展,為系統(tǒng)性研究與DC內(nèi)源性抗原遞呈相關(guān)的Rab蛋白提供了可能。本研究利用基于慢病毒的siRNA干擾技術(shù),構(gòu)建了針對57個Rab家族蛋白的siRNA慢病毒庫。在建立的DC內(nèi)源性抗原遞呈檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上,發(fā)展了大規(guī)模篩選策略,從而觀察干擾Rab家族蛋白表達對DC內(nèi)源性抗原遞呈的影響。結(jié)果顯示一些Rab分子(Rab1B, Rab4A, Rab5B, Rab5C, Rab8A, Rab9,Rab11A,Rab19,Rab24)與DC內(nèi)源遞呈相關(guān)。 結(jié)合這些Rab分子的特殊胞內(nèi)定位特征,我們認(rèn)為:(1)干擾Rab1B、Rab8A,Rab24這些控制胞內(nèi)物質(zhì)由高爾基體往胞膜上轉(zhuǎn)運的Rab蛋白,能夠抑制DC細(xì)胞的內(nèi)源抗原遞呈,這與經(jīng)典的內(nèi)源性抗原遞呈理論一致;(2)Rab4A, Rab5B, Rab5C,Rab11A主要是控制早期內(nèi)吞體與胞膜間轉(zhuǎn)運的Rab蛋白, Rab9則主要與晚期內(nèi)吞體的轉(zhuǎn)運相關(guān),干擾它們的表達抑制DC細(xì)胞的內(nèi)源抗原遞呈,提示DC的內(nèi)源遞呈途徑可能存在經(jīng)典途徑以外的其他途徑。(3)Rab19蛋白功能目前研究并不清楚,可能在DC內(nèi)源抗原遞呈中也發(fā)揮一定作用。以上結(jié)果為進一步解釋DC內(nèi)源抗原遞呈可能機制及Rab蛋白功能奠定了重要基礎(chǔ)。 基于以上研究,我們推測DC細(xì)胞可能存在區(qū)別于經(jīng)典內(nèi)源性抗原遞呈的其他途徑,并與早期內(nèi)吞體相關(guān)。據(jù)此我們選擇與早期內(nèi)吞體回運相關(guān)的Rab4蛋白進行進一步驗證siRNA干擾庫篩選的結(jié)果。 為證實上述推測,我們首先采用化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染DC-OVA細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)瞬時下調(diào)Rab4基因表達對DC內(nèi)源抗原遞呈的抑制作用更為明顯,并且轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面Kb分子也有一定程度下調(diào)。隨后,我們構(gòu)建了Rab4野生型,活化型和抑制型突變體的慢病毒表達載體,轉(zhuǎn)染DC-OVA細(xì)胞后,抗原遞呈檢測結(jié)果顯示其抑制型的突變體可明顯抑制DC內(nèi)源性抗原遞呈,而活性突變體及野生型蛋白則對DC內(nèi)源性抗原遞呈具有促進作用。同時,我們采用共聚焦顯微鏡觀察突變體蛋白在細(xì)胞中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab4蛋白主要分布在細(xì)胞胞膜周圍的囊泡結(jié)構(gòu)中,而對照蛋白則呈彌散表達,野生型和活化型突變體Rab4Q67L主要聚集在胞膜下囊泡中,抑制型突變體Rab4S22N則主要聚集表達在核周囊泡中。這些結(jié)果與庫篩選的結(jié)果一致,并且說明Rab4主要通過其活性的變化和定位改變參與內(nèi)源性抗原遞呈的調(diào)節(jié)。 Rab4蛋白作為早期內(nèi)吞體的標(biāo)志,與Rab5B, Rab5C,Rab11A一起調(diào)節(jié)早期內(nèi)吞體與質(zhì)膜之間的轉(zhuǎn)運,它們對于DC內(nèi)源性抗原遞呈的影響提示,DC內(nèi)源性抗原遞呈胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運可能與早期內(nèi)吞體有關(guān),因此可能與外源抗原的交叉遞呈具有共同途徑,而Rab蛋白很可能因此在DC內(nèi)源性抗原遞呈與外源抗原的交叉遞呈的調(diào)節(jié)中,起著關(guān)鍵性作用,為今后調(diào)節(jié)抗原遞呈從而有效激活腫瘤或感染中細(xì)胞免疫應(yīng)答提供了靶標(biāo)。 總之,本研究利用針對Rab家族蛋白的siRNA庫篩選出與DC內(nèi)源抗原遞呈相關(guān)的Rab蛋白,選擇Rab4蛋白對庫篩選的結(jié)果進行進一步的驗證,并提示Rab4蛋白的活性參與DC細(xì)胞內(nèi)源性抗原遞呈。然而,有關(guān)DC內(nèi)源性抗原遞呈的途徑以及相關(guān)Rab蛋白的調(diào)節(jié)機制,都有待進一步的研究證實。
[Abstract]:Dendritic cells (DC) are the most powerful antigen-presenting cells with the strongest in vivo function. By the way of MHC class I endogenous antigen presenting, it is not only capable of presenting the virus antigen, effectively activating the initial CD8 + T cell, and starting the antiviral immunity, and the process is also an important mechanism for the body to induce the peripheral and central tolerance of the autoantigen. Most of the data on the pathway of endogenous antigen presentation are derived from B cells, and it is believed that the endogenous expression protein can be degraded into 8-10 amino acids by the proteasome digestion after the cytoplasm is generated, and the endoplasmic reticulum (endoplasmic reticulum) can be transported into the endoplasmic reticulum through the trans-processing related transporter (TAP). and with the help of a plurality of molecular chaperones such as calcinin, calreticulin, tapasin and the like, a stable complex is formed with newly generated MHC class I molecules, CD8 + T cells. This process can be seen as a continuous vesicle transport process, and the vesicle transport mechanism involved in this process, we It is also known that the transport of the endometrial structure involves the formation of the vesicles, the movement of the vesicles, the vesicle and the target, Recent cell biology studies have shown that this biological process is regulated by the Rab protein family and its effector molecules, and the different Rab proteins are highly localized on the membrane surface of the various vesicles and can therefore be used to describe Specific endocytosis and specific transport pathways. For example, Rab4 can be used as a marker for early endocytosis, and Rab5 regulates the transport of the cage-shaped proteins between the plasma membrane and the early endocytosis, Rab7 is associated with The formation and transport of the late endocytosis are closely related. Thus, the Rab molecules can be traced as a 鈥渞oad sign鈥，

本文編號：2327861